Cu离子对细胞生长和产品质量的影响研究

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基于细胞性能和产品质量的高通量克隆筛选系统

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聊聊与过滤有关的那些事

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洁净区人员管理大全

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好的细胞是靠好的培养基驯化而来的

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清洁验证中的方法学验证

专栏棉絮 发表了文章 • 0 个评论 • 15 次浏览 • 2016-11-18 14:02 • 来自相关话题

大家好,这是一期从上半年拖到下半年的分享,关于清洁验证的内容已经有多位老师进行过分享,内容都非常精彩、非常系统,今天,我斗胆从一个新的方面展开讨论,“关于清洁验证中检验方法的验证”。
 
一、什么是清洁验证?为什么清洁验证的检验方法要经过验证?
 
我们首先回顾一下,为什么要进行清洁?
清洁是为了除去产品残留、工艺残留和环境污染(removesproduct residues, process residues and environmental contaminants )。
 
清洁验证是为了证明清洁工艺(清洁SOP)能达到预期的清洁目的。
证明的办法就是检查(检验)产品残留、工艺残留和环境污染带来的影响是否降低到足够低。(并不需要最低)
 
清洁验证要保证“设备/系统可以安全地生产后续产品(相同或不同产品)”,相当于对清洁工艺的安全性评估。
因此,清洁验证中所使用的检验方法十分重要,需要进行适当的验证。
 
(举一个不太适当的例子,如果把清洁验证比作是一个产品,那么检验方法就是一把尺,而对检验方法的验证是就对尺的计量。)
 
二、检验方法的建立
 
1、清洁验证的检验往往都需要建立专门的检验方法,这是因为:
A、检验的内容是残留物,因此检验的限度值、线性范围,都与产品的检验有很大的区别。
B、如果是外来污染物(如清洁剂),需要开发专门的检验手段。
C、如果活性成分在清洁过程中发生降解,那么原有的方法可能就不再适用。
 
2、检验方法的建立时需要一些必要的前提
A、首先要确定清洁方法,包括具体的清洁工艺或清洁SOP。
B、要有确定取样方法,因为不同的取样方式会对检测结果造成干扰。
C、最重要的一点,要确定残留物及限度标准,要围绕着残留物的性质和残留限度的大小来选择合适的检验方法。
 
3、选择检验方法建议应考虑的一些因素
A、分析方法的选择会受到实际情况的限制,选择的出发点是该方法能够满足预期的目的。
B、开发新的分析方法时,应该考虑开发新的方法需要时间、人力、仪器成本。
建议首先选用公司现有的分析方法,或对现有方法的限度值进行调整。比如:药典,公司的内控方法。
C、要考虑到清洁工艺的干扰,如使用清洁剂,要包括对特定成份残留的检测,尤其是当清洁剂的pH值变化较大的,还要考虑到清洁剂对活性成份的影响。
D、还要考虑取样过程的影响,如使用棉签擦拭时,需要考虑方法的适用性,棉签的干扰,棉签对回收残留物时的回收率。
 
E、当设备表面取样时的回收率可能低于 100%时,需要进行适当的校正,以保证检验方法的限度要求能够达到。
F、对特定的成份,还要考虑取样至检测的时间间隔,应评估贮存条件(时间、温度、贮存的小瓶等)对样品稳定性的影响。
G、如果活性成份在清洁过程产生降解,还要考虑到对降解产物的分析,或者采用一些非专属性的方法是一个很好的办法。
 
三、清洁验证中检验方法的特定要求
 
清洁验证的一个关键点是确定残留限度,这里的残留通常是指“产品残留”(活性成份)的分析方法验证。
 
通常情况下,清洁验证的方法验证与常用的方法学验证一样,应按照《中国药典》附录9101进行,参照“杂质测定”中定量或限度的方法进行验证,包括准确性、精密度、专属性、线性和范围,以及定量限和检测限等内容,需要注意以下方面:
 
A、准确性和精密度的验证通常只需要在残留限度范围进行,一般为残留物限度的50%-150,综合回收率不低于75%,回收率的RSD应不大于10%。
B、定量限和检测限必须低于样品的可接受限度,而且最好是远低于可接受限度,以确保清洁程序的耐用性。定量限通常达到限度标准的1/10,定量要求低于通常仪器分析的要求。
C、专属性方法应关注可能只有在清洁工艺中使用到的其他物质(例如清洁剂)可能带来的干扰。
 
对于使用合格/不合格方法来进行清洁验证的公司, 不需进行全面的分析方法验证,只需要报告样品的结果是低于或等于或高于合格/不合格限度值。(适用于限度检查)
 
通常内毒素检验方法都是药典方法,不需要进行正式的验证,但需要确认其适用性。
经批准的微生物检验方法也不需要额外的方法验证。
 
四、方法验证与回收率实验
 
指南中提到“分析方法验证方案可以只包括残留物溶液的验证,也可以包括取样回收率研究,尽管取样回收率研究可以独立于分析方法验证而单独进行”。
 
但有些同学会用取样回收率实验(一般是用于擦拭法)来代替方法学验证,这是不全面的,这二者还是有区别的。
 
原因是,清洁验证最关键的是要“防止出现假阴性的情况”,可能是分析方法的灵敏度不够,也可能是取样操作造成干扰, 或者回收率过低,影响因素较多。
 
从时间顺序上来说,应该是先做方法学验证,确认方法的可靠性后再进行取样回收率实验。
(相对于方法学验证,回收率实验是对取样方法的验证)
 
二者关注的范围也不同,分析方法的回收率范围一般为定量限至限度标准(或120%),是为了确认检验方法有足够的灵敏度。而回收率的范围一般在限度标准之上,是为了保证取样操作的可靠性,在清洁不彻底时能够有准确的取样量。
 
同时,二者也有关联,要考虑到取样回收率对分析方法的影响,如果回收率低于100%时,分析方法的限度标准要经过系数的较正,也要考虑检测限/定量限是否能够达到要求。
 
五、参考文献
1、《药品生产验证指南(2003版)》,化学工业出版社。
2、PDA Technical Report No. 29(Revised 2012):Points to Consider for CleaningValidation。
3、FDA:GUIDE TO INSPECTIONS VALIDATION OF CLEANING PROCESSES。
4、《制药企业GMP管理实用指南》,中国计量出版社。
5、《GMP认证指南》
 
(资料准备过程中感谢同事王娟、高玲霞的大力帮助) 查看全部
大家好,这是一期从上半年拖到下半年的分享,关于清洁验证的内容已经有多位老师进行过分享,内容都非常精彩、非常系统,今天,我斗胆从一个新的方面展开讨论,“关于清洁验证中检验方法的验证”。
 
一、什么是清洁验证?为什么清洁验证的检验方法要经过验证?
 
我们首先回顾一下,为什么要进行清洁?
清洁是为了除去产品残留、工艺残留和环境污染(removesproduct residues, process residues and environmental contaminants )。
 
清洁验证是为了证明清洁工艺(清洁SOP)能达到预期的清洁目的。
证明的办法就是检查(检验)产品残留、工艺残留和环境污染带来的影响是否降低到足够低。(并不需要最低)
 
清洁验证要保证“设备/系统可以安全地生产后续产品(相同或不同产品)”,相当于对清洁工艺的安全性评估。
因此,清洁验证中所使用的检验方法十分重要,需要进行适当的验证。
 
(举一个不太适当的例子,如果把清洁验证比作是一个产品,那么检验方法就是一把尺,而对检验方法的验证是就对尺的计量。)
 
二、检验方法的建立
 
1、清洁验证的检验往往都需要建立专门的检验方法,这是因为:
A、检验的内容是残留物,因此检验的限度值、线性范围,都与产品的检验有很大的区别。
B、如果是外来污染物(如清洁剂),需要开发专门的检验手段。
C、如果活性成分在清洁过程中发生降解,那么原有的方法可能就不再适用。
 
2、检验方法的建立时需要一些必要的前提
A、首先要确定清洁方法,包括具体的清洁工艺或清洁SOP。
B、要有确定取样方法,因为不同的取样方式会对检测结果造成干扰。
C、最重要的一点,要确定残留物及限度标准,要围绕着残留物的性质和残留限度的大小来选择合适的检验方法。
 
3、选择检验方法建议应考虑的一些因素
A、分析方法的选择会受到实际情况的限制,选择的出发点是该方法能够满足预期的目的。
B、开发新的分析方法时,应该考虑开发新的方法需要时间、人力、仪器成本。
建议首先选用公司现有的分析方法,或对现有方法的限度值进行调整。比如:药典,公司的内控方法。
C、要考虑到清洁工艺的干扰,如使用清洁剂,要包括对特定成份残留的检测,尤其是当清洁剂的pH值变化较大的,还要考虑到清洁剂对活性成份的影响。
D、还要考虑取样过程的影响,如使用棉签擦拭时,需要考虑方法的适用性,棉签的干扰,棉签对回收残留物时的回收率。
 
E、当设备表面取样时的回收率可能低于 100%时,需要进行适当的校正,以保证检验方法的限度要求能够达到。
F、对特定的成份,还要考虑取样至检测的时间间隔,应评估贮存条件(时间、温度、贮存的小瓶等)对样品稳定性的影响。
G、如果活性成份在清洁过程产生降解,还要考虑到对降解产物的分析,或者采用一些非专属性的方法是一个很好的办法。
 
三、清洁验证中检验方法的特定要求
 
清洁验证的一个关键点是确定残留限度,这里的残留通常是指“产品残留”(活性成份)的分析方法验证。
 
通常情况下,清洁验证的方法验证与常用的方法学验证一样,应按照《中国药典》附录9101进行,参照“杂质测定”中定量或限度的方法进行验证,包括准确性、精密度、专属性、线性和范围,以及定量限和检测限等内容,需要注意以下方面:
 
A、准确性和精密度的验证通常只需要在残留限度范围进行,一般为残留物限度的50%-150,综合回收率不低于75%,回收率的RSD应不大于10%。
B、定量限和检测限必须低于样品的可接受限度,而且最好是远低于可接受限度,以确保清洁程序的耐用性。定量限通常达到限度标准的1/10,定量要求低于通常仪器分析的要求。
C、专属性方法应关注可能只有在清洁工艺中使用到的其他物质(例如清洁剂)可能带来的干扰。
 
对于使用合格/不合格方法来进行清洁验证的公司, 不需进行全面的分析方法验证,只需要报告样品的结果是低于或等于或高于合格/不合格限度值。(适用于限度检查)
 
通常内毒素检验方法都是药典方法,不需要进行正式的验证,但需要确认其适用性。
经批准的微生物检验方法也不需要额外的方法验证。
 
四、方法验证与回收率实验
 
指南中提到“分析方法验证方案可以只包括残留物溶液的验证,也可以包括取样回收率研究,尽管取样回收率研究可以独立于分析方法验证而单独进行”。
 
但有些同学会用取样回收率实验(一般是用于擦拭法)来代替方法学验证,这是不全面的,这二者还是有区别的。
 
原因是,清洁验证最关键的是要“防止出现假阴性的情况”,可能是分析方法的灵敏度不够,也可能是取样操作造成干扰, 或者回收率过低,影响因素较多。
 
从时间顺序上来说,应该是先做方法学验证,确认方法的可靠性后再进行取样回收率实验。
(相对于方法学验证,回收率实验是对取样方法的验证)
 
二者关注的范围也不同,分析方法的回收率范围一般为定量限至限度标准(或120%),是为了确认检验方法有足够的灵敏度。而回收率的范围一般在限度标准之上,是为了保证取样操作的可靠性,在清洁不彻底时能够有准确的取样量。
 
同时,二者也有关联,要考虑到取样回收率对分析方法的影响,如果回收率低于100%时,分析方法的限度标准要经过系数的较正,也要考虑检测限/定量限是否能够达到要求。
 
五、参考文献
1、《药品生产验证指南(2003版)》,化学工业出版社。
2、PDA Technical Report No. 29(Revised 2012):Points to Consider for CleaningValidation。
3、FDA:GUIDE TO INSPECTIONS VALIDATION OF CLEANING PROCESSES。
4、《制药企业GMP管理实用指南》,中国计量出版社。
5、《GMP认证指南》
 
(资料准备过程中感谢同事王娟、高玲霞的大力帮助)

切向流过滤技术的原理和应用

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大批量细胞收获液的澄清过滤

专栏cnvax 发表了文章 • 0 个评论 • 45 次浏览 • 2016-09-29 20:12 • 来自相关话题

大批量细胞收获液的澄清过滤
一次性使用的过滤系统受到越来越多的生物制品公司推崇,本文旨在介绍3M净化事业部的新产品EZP(Encapsulated Zetaplus)一次性使用深层过滤系统,该系统专门针对大批量细胞收获液的澄清过滤而设计开发。同时,本文通过3个试验案例,阐述了EZP的优越性。
细胞收获液的澄清是生物制药工艺中下游纯化的第一步,通常使用离心机、 深层过滤或切向流技术(Tangential Flow Filtration,以下简称TFF),对适用于“大批量”、一次性使用的深层过滤技术,因其可以提高产品品质、简化操作,而越来越受到业内推崇。本文 旨在介绍3M一次性深层过滤系统EZP,应用于大批量细胞收获液的澄清过滤。

细胞收获液的澄清
澄清目的是有效分离收获液中的细胞、细胞碎片和其他胶状物质,为下游纯化(例如Protein A层析柱)提供无杂质的料液。该工艺有很多应用技术,如图1所示,离心、切向流(TFF)、絮凝以及深层过滤,通常采用多种技术组合的方式。如果只采用深 层过滤技术,通常使用两级过滤:第一级使用孔径较大的过滤介质,去除细胞或者细胞碎片;第二级使用孔径紧密的过滤介质,去除胶体杂质。对于高密度细胞收获 液,投加聚合树脂或壳聚糖的絮凝法,再配合深层过滤是业内普遍采用的有效澄清工艺。

为降低生物负载,避免下游层析纯化柱过早堵塞,澄清工艺最后会配合0.45μm、0.2μm的终端除菌过滤。
工艺开发工程师会根据收获液的性质、分离的需要、有效性的验证以及操作性等因素进行澄清技术的选择。
离心机用于澄清工艺已经比较成熟,但用于生物制药工艺则面临巨大挑战。细胞收获液的杂质粒径大小分布很广,均质后的收获液中,杂质粒径会更小而且含水量 高,这些杂质与收获液几乎没有密度区别。而且,由于剪切力、存在无活性的细胞,以及细胞内组分(例如:核酸)等因素会导致收获液粘度的明显增加。这些都影 响离心机对收获液的澄清效果。
因此,根据工艺开发工程师的经验,离心机适用于批量高于2000L的上游收获液的初步澄清,对于下游浓缩纯化并不适用。另外,对于高细胞密度的上游收获 液,例如细胞密度高于1.5×108细胞/mL,单抗浓度高于25g/L,离心技术也面临挑战。所以,通常在离心之后配合使用深层过滤。
切向流(TFF)配合微滤膜过滤是目前生物制药领域被广泛采用的澄清工艺。切向流(TFF)最大的优势在于,滤出液体积小、无杂质,可达到Protein A层析柱的上柱要求。切向流通常具有较高的初始通量,但是如果反向膜的压力没有控制好,就会很快形成滤饼,导致初始条件下流速大大降低,并且随着过滤浓缩 的进行,这种现象不可避免。TFF配备的流道的直径和泵的处理粘度决定了可以处理的料液中悬浮固体的量。料液的高细胞密度会影响TFF的浓缩比和渗透液的 收率。另外,因膜上游的料液一直处于循环状态,剪切力会造成细胞破裂。因此TFF并不是澄清过滤工艺的首选。

深层过滤系统
因其相对于离心机和切向流(TFF)的低成本和易验证的优势,深层过滤系统被广泛用于细胞收获液的澄清。深层过滤系统可以非常有效地滤除收杂质,避免终端除菌膜过滤器过早堵塞,从而延长使用寿命。
多数深层过滤介质都是由纤维素、助滤剂以及带电树脂制成,具有一定的润湿拉伸强度并且表面带有正电核。深层过滤介质的原料是纸浆,工艺类似造纸,首先做成纸板,然后根据生物制药的工艺要求,制成滤囊或者滤芯,安装在支架或滤筒中。
纤维素组成了滤芯中的网状结构,纤维之间的空隙用于捕捉料液中的颗粒,随着过滤的进行,颗粒堆积在表面形成滤饼,会提高过滤的效率。同时随着滤饼越来越 厚,也会降低过滤速度。在纤维中加入硅藻土,可以提高在形成滤饼后的过滤速度。肉眼观察硅藻土是非常细小的颗粒,在放大电镜下,可以看到它表明有很多亚微 米的空隙,可以拦截细小颗粒。
深层过滤介质的第三个组分是树脂,它有两个方面作用,一是粘结纤维,二是提供过滤介质表面的正电荷。这些正电荷可以吸附带负电、比过滤孔径小很多的细胞碎 片等杂质。深层过滤滤芯通常做成模堆,放置在不锈钢滤筒中。这种过滤系统的容污量大大高于折叠膜和线绕滤芯,可拦截、吸附大量细胞和细胞碎片。

传统深层过滤系统
大批量细胞培养是生物制药的发展趋势,对于批量15000L的收获液,需要多个传统深层过滤系统。在过滤前,需先采用水或者缓冲液冲洗过滤系统,去除模堆 表面的污染物;过滤结束后,需要用冲洗的方法将滤筒中残留的收获液冲洗出来,提高收率。使用这种操作方式,可以最高达到95%的收率。
随着生物反应罐的体积不断增加,使用这种传统的过滤方式变的复杂和繁琐。滤筒多,滤芯数量大,更换滤芯时,需要停机,打开滤筒,取出湿漉漉的滤芯,装入新的滤芯,还要确保滤筒密封良好。而且,停机才能进行CIP清洗,进行清洗验证。停机次数会大大影响工厂的生产效率。
一次性使用的深层过滤系统EZP,是3M过滤净化事业部针对生物制药工艺开发的新产品。该系统包含一个带有进口和出口的顶板,及可以放置多个滤囊的支架。 这个支架采用人体工学设计,可以将多个滤囊在支架水平位置放入,然后通过摇柄将支架竖立,进行垂直过滤,见图2所示。各个滤囊之间采用CAM密封锁装置, 确保密封。滤囊内部的过滤介质与传统深层过滤系统中的过滤介质一样,精度和型号有多种选择。另外,EZP占地面积小,节省了洁净室的空间。相比传统的深层 过滤系统,EZP不需要固定资产投资,安装位置灵活操作简单,适合工艺开发。

案例分析
案例一
对比现有“半厚度”双层过滤介质与EZP的“全厚度”双层过滤介质。“全厚度”是指一个滤囊中,有上下2个不同过滤精度的过滤纸板。通常上游的纸板孔径较大,用于拦截大颗粒杂质;下游纸板孔小,用于小颗粒和细胞碎片捕集。这种设计提高了过滤器的通量,延长了使用寿命。
如图3所示,现有工艺为CHO细胞收获液600L,采用 “半厚度”双层过滤介质Zetaplus 10M02配合60M05组成的2级过滤,传统的不锈钢滤筒。 试验采用“全厚度” 过滤介质Zetaplus 10SP02A配合 60SP05A。考虑过滤介质带电量的影响,同时对比,Zetaplus 10SP02A配合带有更高电量的Zetaplus 60ZA05做第二级过滤。
测试采用3M生产的47mm膜片和不锈钢夹套进行,过滤面积13.5cm2,按照面积进行等比例缩小。
测试结果见图6所示。采用10M02配合60M05的过滤组合,换算得,通量为135L/m2;采用“全厚度”双层EXT过滤介质,10SP02A配合 60SP05A的过滤组合,通量也是135L/m2左右;但是从图中可以看到,“全厚度”双层过滤介质的压差比较大,过滤后料液的浊度低为3NTU,而 “半厚度”双层介质的过滤后浊度为5NTU。采用10SP02A配合60ZA05A,过滤过程中的压差明显比较低,并且澄清度更高,浊度仅为 1.5NTU。
基于以上测试结果,将过滤系统放大到生产规模。
在生产中,进口压力5.6~6.0Psi,流速150L/m2。使用传统不锈钢滤筒系统完成过滤耗时9~10h,而采用EZP系统,过滤完成时间缩短到3h。其他优势:
可见的观测:EZP的滤囊外壳是半透明的塑料,可以观察到过滤过程中,滤囊内部的流动情况
操作简易:操作人员不需要像打开滤筒一样,拧开螺栓或者卡箍。不需要安装O型圈,滤囊两端都有固定的O型圈和CAM密封锁,可以确保安装位置和密封性。滤囊上有排气孔,可以打开放气,避免形成“气锁”。
EZP的占地面积小,支架采用人体工学设计:过滤系统占地小,节省了洁净室的空间;人体工学设计的支架,可以在腰部位置进行安装和拆卸,有效提高了效率,节省劳动力,提高安全性。

案例二
该试验的目的是评估EZP对延长终端0.2μm除菌膜使用寿命的影响。
目前大多数生物制药生产中,对于10000LCHO收获液,通常采用离心、深层过滤和终端0.2μm除菌过滤的组合方式进行澄清过滤。通常情况下全部过滤 10000L,浊度140NTU,细胞密度5.4×106的CHO收获液,过滤到一半,0.2μm的终端滤芯就因为堵塞而需要更换了。同时,因为搅拌器作 用,会将收获液的细胞密度升高,浊度也从140NTU上升到170NTU,这对离心和深层过滤都是挑战。试验在于,选择合适的深层过滤介质,全部过滤完 10000L收获液,不更换0.2μm终端除菌滤芯。
第一次测试,选用高精度、单层的深层过滤介质Zetaplus90ZA。按照实际批量缩小,采用47mm 90ZA膜片(面积13.5cm2),流速为2mL/min,再配合47mm的3M LifeASSURE PDA PES 0.2μm终端滤膜进行过滤,10000L的批量缩小为364mL。在过滤到相当于5000L料液时,即182mL,90ZA都是没有明显压差上升的;在 全部过滤结束后,90ZA的滤出液浊度29.7NTU。0.2μm终端膜在深层过滤的滤出液浊度达到10NTU时,开始堵塞。见图6所示。
第二次测试,分别选用双层全厚度、深层过滤介质Zetaplus 90ZA08(上层60ZA和下层90ZA)和120ZA10A(上层90ZA和下层120ZA),采用47mm的膜片,流速4mL/min(0.2L /min/ft2),再配合47mm的LifeASSURE PDA PES 0.2μm膜片。与第一次测试相同,过滤通量为364mL。在过滤结束时,90ZA08和120ZA10A深层过滤的压差,最大达到了 22Psid;90ZA08过滤后料液的浊度是32NTU与第一次采用60ZA过滤后的结果相似。这说明90ZA没有拦截住小颗粒,从而没有起到保护下游 0.2μm终端过滤膜的作用。
120ZA10A的滤出液浊度为7NTU,是理想的保护0.2μm终端过滤膜的深层过滤介质。
考虑到120ZA10A在第二次试验中的压差高,第三次试验选用Zetaplus60ZA05A(上层30ZA和下层60Z)和 Zetaplus90ZA08A(上层60ZA和下层90ZA)串联。测试条件与前两次相同。结果显示,使用一级90ZA08A 双层介质,其滤出液浊度9.0NTU,过滤结束后0.2μm终端除菌膜的压差为15Psid;使用60ZA05A和90ZA08A两级深层过滤介质串联, 滤出液的浊度为4.5NTU,终端0.2μm除菌膜的压差只有6psid。
所以,根据测试结果,实际工艺过滤10000LCHO收获液,只需要1个EZP系统,在支架上放置2级不同精度的滤囊(60ZA05A和90ZA08A),就可以达到过滤效果,并且至过滤结束,无需更换0.2μm终端除菌滤芯。

案例三
本案例评估采用EZP替换离心机的可行性。见图9所示。现有工艺为连续式离心机,60SP深层过滤系统和0.2μm终端除菌过滤的组合方式。新的工艺,采 用“全厚度”双层过滤介质60SP02A替代离心机,再配合0.2μm终端除菌过滤。按照面积缩小,采用47mm膜片进行过滤小试,过滤相当于1000L 料液的量,结果显示,0.2μm终端除菌过滤器的压差没有明显上升,深层过滤系统很好的保护了终端过滤系统。
在生产中,过滤收获液1000L,采用EZP配7个“全厚度”双层过滤介质60SP02A滤囊,每个滤囊的过滤面积1.6m2,至过滤结束,0.2μm除菌滤芯的压差并未见明显上升。试验证实,EZP可以完全替代离心机。
同时操作人员反馈:
EZP比传统的不锈钢滤筒方式,残留量少;
EZP安装、操作简易;
EZP无需CIP和清洗验证,减少了成本;
EZP大大缩小了过滤时间,提高了生产效率。
以上3个案例表明,一次性深层过滤系统不仅完全适用于大批量的生物制药工艺,而且比传统工艺更具优势。
小结
深层过滤因其有效性和灵活性,在生物制药领域广受推崇,而“一次性”技术是新的趋势。本文论证了“一次性”深层过滤技术的高效性,并且这项技术已经被广泛采用。
3M净化事业部成功研发了EZP一次性深层过滤产品,该产品拥有多项创新设计。首先,滤囊外壳采用半透明塑料,可直观的看到料液在滤囊内的残留和空体积; 外壳承受50psi的压力;对需要NaOH清洗的场合,提供抗碱性的滤囊;考虑“无泄漏”而专门设计的CAM密封锁装置。同时,工程师们也考虑了多种方式 优化滤囊支架,最终确定了水平安装和垂直过滤的方式,人体工学设计的“摇柄”控制方位转换。
EZP不仅可以用于细胞收获液的澄清过滤,因过滤介质表面带有正电荷,还可以吸附去除比孔径小的杂质。根据近期的研究,Zetaplus可用于吸附去除宿 主细胞蛋白,120ZA10A可以将宿主蛋白DNA含量从55?968ng/mg蛋白降低至183ng/mg蛋白。深层过滤介质也可以用于去除病毒,最高 可达到降低4个Log。研究还发现带电的深层过滤介质可以去除非包膜的RNA病毒(鼠细小病毒),工艺流速320L/m2,病毒含量2%。
一次性深层过滤系统EZP具有明显的操作优势,不仅可以应用于收获液澄清过滤,同时因其带有正电荷,可以有效地去除病毒、宿主蛋白和DNA。 查看全部
大批量细胞收获液的澄清过滤
一次性使用的过滤系统受到越来越多的生物制品公司推崇,本文旨在介绍3M净化事业部的新产品EZP(Encapsulated Zetaplus)一次性使用深层过滤系统,该系统专门针对大批量细胞收获液的澄清过滤而设计开发。同时,本文通过3个试验案例,阐述了EZP的优越性。
细胞收获液的澄清是生物制药工艺中下游纯化的第一步,通常使用离心机、 深层过滤或切向流技术(Tangential Flow Filtration,以下简称TFF),对适用于“大批量”、一次性使用的深层过滤技术,因其可以提高产品品质、简化操作,而越来越受到业内推崇。本文 旨在介绍3M一次性深层过滤系统EZP,应用于大批量细胞收获液的澄清过滤。

细胞收获液的澄清
澄清目的是有效分离收获液中的细胞、细胞碎片和其他胶状物质,为下游纯化(例如Protein A层析柱)提供无杂质的料液。该工艺有很多应用技术,如图1所示,离心、切向流(TFF)、絮凝以及深层过滤,通常采用多种技术组合的方式。如果只采用深 层过滤技术,通常使用两级过滤:第一级使用孔径较大的过滤介质,去除细胞或者细胞碎片;第二级使用孔径紧密的过滤介质,去除胶体杂质。对于高密度细胞收获 液,投加聚合树脂或壳聚糖的絮凝法,再配合深层过滤是业内普遍采用的有效澄清工艺。

为降低生物负载,避免下游层析纯化柱过早堵塞,澄清工艺最后会配合0.45μm、0.2μm的终端除菌过滤。
工艺开发工程师会根据收获液的性质、分离的需要、有效性的验证以及操作性等因素进行澄清技术的选择。
离心机用于澄清工艺已经比较成熟,但用于生物制药工艺则面临巨大挑战。细胞收获液的杂质粒径大小分布很广,均质后的收获液中,杂质粒径会更小而且含水量 高,这些杂质与收获液几乎没有密度区别。而且,由于剪切力、存在无活性的细胞,以及细胞内组分(例如:核酸)等因素会导致收获液粘度的明显增加。这些都影 响离心机对收获液的澄清效果。
因此,根据工艺开发工程师的经验,离心机适用于批量高于2000L的上游收获液的初步澄清,对于下游浓缩纯化并不适用。另外,对于高细胞密度的上游收获 液,例如细胞密度高于1.5×108细胞/mL,单抗浓度高于25g/L,离心技术也面临挑战。所以,通常在离心之后配合使用深层过滤。
切向流(TFF)配合微滤膜过滤是目前生物制药领域被广泛采用的澄清工艺。切向流(TFF)最大的优势在于,滤出液体积小、无杂质,可达到Protein A层析柱的上柱要求。切向流通常具有较高的初始通量,但是如果反向膜的压力没有控制好,就会很快形成滤饼,导致初始条件下流速大大降低,并且随着过滤浓缩 的进行,这种现象不可避免。TFF配备的流道的直径和泵的处理粘度决定了可以处理的料液中悬浮固体的量。料液的高细胞密度会影响TFF的浓缩比和渗透液的 收率。另外,因膜上游的料液一直处于循环状态,剪切力会造成细胞破裂。因此TFF并不是澄清过滤工艺的首选。

深层过滤系统
因其相对于离心机和切向流(TFF)的低成本和易验证的优势,深层过滤系统被广泛用于细胞收获液的澄清。深层过滤系统可以非常有效地滤除收杂质,避免终端除菌膜过滤器过早堵塞,从而延长使用寿命。
多数深层过滤介质都是由纤维素、助滤剂以及带电树脂制成,具有一定的润湿拉伸强度并且表面带有正电核。深层过滤介质的原料是纸浆,工艺类似造纸,首先做成纸板,然后根据生物制药的工艺要求,制成滤囊或者滤芯,安装在支架或滤筒中。
纤维素组成了滤芯中的网状结构,纤维之间的空隙用于捕捉料液中的颗粒,随着过滤的进行,颗粒堆积在表面形成滤饼,会提高过滤的效率。同时随着滤饼越来越 厚,也会降低过滤速度。在纤维中加入硅藻土,可以提高在形成滤饼后的过滤速度。肉眼观察硅藻土是非常细小的颗粒,在放大电镜下,可以看到它表明有很多亚微 米的空隙,可以拦截细小颗粒。
深层过滤介质的第三个组分是树脂,它有两个方面作用,一是粘结纤维,二是提供过滤介质表面的正电荷。这些正电荷可以吸附带负电、比过滤孔径小很多的细胞碎 片等杂质。深层过滤滤芯通常做成模堆,放置在不锈钢滤筒中。这种过滤系统的容污量大大高于折叠膜和线绕滤芯,可拦截、吸附大量细胞和细胞碎片。

传统深层过滤系统
大批量细胞培养是生物制药的发展趋势,对于批量15000L的收获液,需要多个传统深层过滤系统。在过滤前,需先采用水或者缓冲液冲洗过滤系统,去除模堆 表面的污染物;过滤结束后,需要用冲洗的方法将滤筒中残留的收获液冲洗出来,提高收率。使用这种操作方式,可以最高达到95%的收率。
随着生物反应罐的体积不断增加,使用这种传统的过滤方式变的复杂和繁琐。滤筒多,滤芯数量大,更换滤芯时,需要停机,打开滤筒,取出湿漉漉的滤芯,装入新的滤芯,还要确保滤筒密封良好。而且,停机才能进行CIP清洗,进行清洗验证。停机次数会大大影响工厂的生产效率。
一次性使用的深层过滤系统EZP,是3M过滤净化事业部针对生物制药工艺开发的新产品。该系统包含一个带有进口和出口的顶板,及可以放置多个滤囊的支架。 这个支架采用人体工学设计,可以将多个滤囊在支架水平位置放入,然后通过摇柄将支架竖立,进行垂直过滤,见图2所示。各个滤囊之间采用CAM密封锁装置, 确保密封。滤囊内部的过滤介质与传统深层过滤系统中的过滤介质一样,精度和型号有多种选择。另外,EZP占地面积小,节省了洁净室的空间。相比传统的深层 过滤系统,EZP不需要固定资产投资,安装位置灵活操作简单,适合工艺开发。

案例分析
案例一
对比现有“半厚度”双层过滤介质与EZP的“全厚度”双层过滤介质。“全厚度”是指一个滤囊中,有上下2个不同过滤精度的过滤纸板。通常上游的纸板孔径较大,用于拦截大颗粒杂质;下游纸板孔小,用于小颗粒和细胞碎片捕集。这种设计提高了过滤器的通量,延长了使用寿命。
如图3所示,现有工艺为CHO细胞收获液600L,采用 “半厚度”双层过滤介质Zetaplus 10M02配合60M05组成的2级过滤,传统的不锈钢滤筒。 试验采用“全厚度” 过滤介质Zetaplus 10SP02A配合 60SP05A。考虑过滤介质带电量的影响,同时对比,Zetaplus 10SP02A配合带有更高电量的Zetaplus 60ZA05做第二级过滤。
测试采用3M生产的47mm膜片和不锈钢夹套进行,过滤面积13.5cm2,按照面积进行等比例缩小。
测试结果见图6所示。采用10M02配合60M05的过滤组合,换算得,通量为135L/m2;采用“全厚度”双层EXT过滤介质,10SP02A配合 60SP05A的过滤组合,通量也是135L/m2左右;但是从图中可以看到,“全厚度”双层过滤介质的压差比较大,过滤后料液的浊度低为3NTU,而 “半厚度”双层介质的过滤后浊度为5NTU。采用10SP02A配合60ZA05A,过滤过程中的压差明显比较低,并且澄清度更高,浊度仅为 1.5NTU。
基于以上测试结果,将过滤系统放大到生产规模。
在生产中,进口压力5.6~6.0Psi,流速150L/m2。使用传统不锈钢滤筒系统完成过滤耗时9~10h,而采用EZP系统,过滤完成时间缩短到3h。其他优势:
可见的观测:EZP的滤囊外壳是半透明的塑料,可以观察到过滤过程中,滤囊内部的流动情况
操作简易:操作人员不需要像打开滤筒一样,拧开螺栓或者卡箍。不需要安装O型圈,滤囊两端都有固定的O型圈和CAM密封锁,可以确保安装位置和密封性。滤囊上有排气孔,可以打开放气,避免形成“气锁”。
EZP的占地面积小,支架采用人体工学设计:过滤系统占地小,节省了洁净室的空间;人体工学设计的支架,可以在腰部位置进行安装和拆卸,有效提高了效率,节省劳动力,提高安全性。

案例二
该试验的目的是评估EZP对延长终端0.2μm除菌膜使用寿命的影响。
目前大多数生物制药生产中,对于10000LCHO收获液,通常采用离心、深层过滤和终端0.2μm除菌过滤的组合方式进行澄清过滤。通常情况下全部过滤 10000L,浊度140NTU,细胞密度5.4×106的CHO收获液,过滤到一半,0.2μm的终端滤芯就因为堵塞而需要更换了。同时,因为搅拌器作 用,会将收获液的细胞密度升高,浊度也从140NTU上升到170NTU,这对离心和深层过滤都是挑战。试验在于,选择合适的深层过滤介质,全部过滤完 10000L收获液,不更换0.2μm终端除菌滤芯。
第一次测试,选用高精度、单层的深层过滤介质Zetaplus90ZA。按照实际批量缩小,采用47mm 90ZA膜片(面积13.5cm2),流速为2mL/min,再配合47mm的3M LifeASSURE PDA PES 0.2μm终端滤膜进行过滤,10000L的批量缩小为364mL。在过滤到相当于5000L料液时,即182mL,90ZA都是没有明显压差上升的;在 全部过滤结束后,90ZA的滤出液浊度29.7NTU。0.2μm终端膜在深层过滤的滤出液浊度达到10NTU时,开始堵塞。见图6所示。
第二次测试,分别选用双层全厚度、深层过滤介质Zetaplus 90ZA08(上层60ZA和下层90ZA)和120ZA10A(上层90ZA和下层120ZA),采用47mm的膜片,流速4mL/min(0.2L /min/ft2),再配合47mm的LifeASSURE PDA PES 0.2μm膜片。与第一次测试相同,过滤通量为364mL。在过滤结束时,90ZA08和120ZA10A深层过滤的压差,最大达到了 22Psid;90ZA08过滤后料液的浊度是32NTU与第一次采用60ZA过滤后的结果相似。这说明90ZA没有拦截住小颗粒,从而没有起到保护下游 0.2μm终端过滤膜的作用。
120ZA10A的滤出液浊度为7NTU,是理想的保护0.2μm终端过滤膜的深层过滤介质。
考虑到120ZA10A在第二次试验中的压差高,第三次试验选用Zetaplus60ZA05A(上层30ZA和下层60Z)和 Zetaplus90ZA08A(上层60ZA和下层90ZA)串联。测试条件与前两次相同。结果显示,使用一级90ZA08A 双层介质,其滤出液浊度9.0NTU,过滤结束后0.2μm终端除菌膜的压差为15Psid;使用60ZA05A和90ZA08A两级深层过滤介质串联, 滤出液的浊度为4.5NTU,终端0.2μm除菌膜的压差只有6psid。
所以,根据测试结果,实际工艺过滤10000LCHO收获液,只需要1个EZP系统,在支架上放置2级不同精度的滤囊(60ZA05A和90ZA08A),就可以达到过滤效果,并且至过滤结束,无需更换0.2μm终端除菌滤芯。

案例三
本案例评估采用EZP替换离心机的可行性。见图9所示。现有工艺为连续式离心机,60SP深层过滤系统和0.2μm终端除菌过滤的组合方式。新的工艺,采 用“全厚度”双层过滤介质60SP02A替代离心机,再配合0.2μm终端除菌过滤。按照面积缩小,采用47mm膜片进行过滤小试,过滤相当于1000L 料液的量,结果显示,0.2μm终端除菌过滤器的压差没有明显上升,深层过滤系统很好的保护了终端过滤系统。
在生产中,过滤收获液1000L,采用EZP配7个“全厚度”双层过滤介质60SP02A滤囊,每个滤囊的过滤面积1.6m2,至过滤结束,0.2μm除菌滤芯的压差并未见明显上升。试验证实,EZP可以完全替代离心机。
同时操作人员反馈:
EZP比传统的不锈钢滤筒方式,残留量少;
EZP安装、操作简易;
EZP无需CIP和清洗验证,减少了成本;
EZP大大缩小了过滤时间,提高了生产效率。
以上3个案例表明,一次性深层过滤系统不仅完全适用于大批量的生物制药工艺,而且比传统工艺更具优势。
小结
深层过滤因其有效性和灵活性,在生物制药领域广受推崇,而“一次性”技术是新的趋势。本文论证了“一次性”深层过滤技术的高效性,并且这项技术已经被广泛采用。
3M净化事业部成功研发了EZP一次性深层过滤产品,该产品拥有多项创新设计。首先,滤囊外壳采用半透明塑料,可直观的看到料液在滤囊内的残留和空体积; 外壳承受50psi的压力;对需要NaOH清洗的场合,提供抗碱性的滤囊;考虑“无泄漏”而专门设计的CAM密封锁装置。同时,工程师们也考虑了多种方式 优化滤囊支架,最终确定了水平安装和垂直过滤的方式,人体工学设计的“摇柄”控制方位转换。
EZP不仅可以用于细胞收获液的澄清过滤,因过滤介质表面带有正电荷,还可以吸附去除比孔径小的杂质。根据近期的研究,Zetaplus可用于吸附去除宿 主细胞蛋白,120ZA10A可以将宿主蛋白DNA含量从55?968ng/mg蛋白降低至183ng/mg蛋白。深层过滤介质也可以用于去除病毒,最高 可达到降低4个Log。研究还发现带电的深层过滤介质可以去除非包膜的RNA病毒(鼠细小病毒),工艺流速320L/m2,病毒含量2%。
一次性深层过滤系统EZP具有明显的操作优势,不仅可以应用于收获液澄清过滤,同时因其带有正电荷,可以有效地去除病毒、宿主蛋白和DNA。

QbD:新法规下药品研发的质量保证

专栏cnvax 发表了文章 • 0 个评论 • 49 次浏览 • 2016-09-29 20:10 • 来自相关话题

 
鉴于QbD在我国药品研发中的应用势在必行,王兴旺博士以多个具体的研发实例告诉研发主管:可在研发的不同阶段适当加入一些QbD元素,如研发目标(QTPP)、CQA、CMA、CPP和控制策略;可在研发的不同阶段适当采用一些QbD工具,如风险评估和先前知识。
 
QbD的精髓
 
QbD的理念这个最早来自ESQM,QbD与Q9风险管理,Q10质量体系,Q11刚刚发布原料药研发,QE制剂研发。这样四到五个指导原则我们可以合在一起称之为QbD系列指导原则。所谓的QbD它的基本内容有几个名词,首先就是以预先设定一个叫做目标产品质量概况,确定一个产品的关键质量属性,简称CQA,这两个做好以后我们可以做评估,一个叫做CMA,第二就是CQA。与药品研发有关的QbD主要是涉及到工艺验证第一个工艺设计,第一阶段就是工艺设计概念。这里面包括三方面内容,一个围绕产品开发管理,第二围绕工艺开发理解,最后建立控制策略,在我们工艺设计。
 
QbD方法更强调产品理解,基于分析评估,要把CMA与CQA相关联,更强调工艺理解,基于风险评估,将CMA和CPP与产品的CQA相关联。它所建立的控制策略应该说是全面综合的。QbD的重要工具首当其冲是风险评估,第二是过程分析技术,第三DOE,这个我们国内基本上不做的。第四个模型模拟,下面先前知识与知识管理,还有质量体系。因此QbD是一个科学基于风险全面主动的指控模式。QbD的方法在国际上广泛应用于生产工艺的验证,从去年1月1号开始在美国申请仿制药,美国的FGA,已经强制要求工艺设计部分必须提交QbD的申报资料。
 
要说QbD的精髓可以从这样三个方面理解,一个方面可以认为这种现代的药品研发方法可以说成QbD方法,生命周期方法跟传统方法有所区别,最主要区别就是强调科学知识和风险评估的有机结合。
 
第二个方面可以把QbD认为是一种哲学,它遵循始与终的辩证统一,希望追求目标是自始至终,始终如一。比如说强调以终为始,强化研发目标,强调有始有终,突出过程控制,善始善终,注重持续改进,希望通过初始设计确保最终的质量,产品质量,分析方法质量,这是一种哲学。
 
第三个方面可以把QbD看成是一门艺术,实施产品工艺、分析方法的产品生命周期管理,所以QbD方法也叫做生命周期方法。
 
理念的具体应用
 
下面我们重点分享QbD的理念,如何在研发当中具体的应用。包括三个方面内容。
 
一个研发开始前,第二研发过程中,第三个研发结束的时候。我们看看QbD理念如何具体的应用。
 
先看第一方面研发开始前的应用,主要包括我刚才讲的两个方面,一个QTPP,一个是CQA,在研发工作开始之前我们必须明确。这个QTPP概念指产品质量属性前瞻性总结,但是这个产品质量属性可以认为是一个广义大概念。CQA是一个品种的物理、化学、生物学方面的性质和特征,这个必须控制在一个范围分布里面这个成为CQA了。
 
 QTPP确定的过程可以通过一张表的形式表现出来,包括要素、目标、合理性说明,比如说要素可以包括适应症、药品质量属性,比如讲中间的质量属性,成品的质量属性,药典对某一种剂型的规定等等。包装系统给予方式和说明书的一致性。最后一项可替代的给予方式,这里展现了QTPP确定的一个过程。这个值得注意的是给予方式与说明书的一致性,你看这个写了两个方面的内容,一个是有没有饮食禁忌,服用药片考虑不考虑食物影响,咖啡、饮酒要注意。如果是一个注射剂,比如讲有一个小水针需要吸收,这个时候给予方式与说明书的一致性要说清楚,你用的稀释溶剂到底是什么,用了多少量,在什么样条件下,这样一个稀释以后的溶剂在临床上能放多长时间,配合稳定性,使用稳定性的话题。
 
可代替的给药方式有也要说明,比如说分散片分散到温水里面给他服用,说明书有其他服用方法,比如讲放在口腔里面口嚼然后服用,这方面也要说清楚。
 
确定CQA可以通过这样一个说明书,主要是从药品的药效性、安全性的角度来看看它是不是这个产品的CQA,当然有可能是有可能不是,如果不能确定的时候需要进一步研究。如果是CQA以后还要进一步去看这个CQA是不是受到产品或者工艺的影响,如果是影响就是我们风险评估深入研究的对象,如果不受影响我们可以不做风险评估深入研究。
 
这里有一个CQA的确定过程,也可以通过一张表反映,列出产品质量属性、目标是否为CQA,是否需要风险评估深入研究,给予合理性的说明。比如说这样一个药片,可以包括外观形状、气味、尺寸大小,有刻痕。颜色和形状不直接与有效性发生关联因此它们都不是CQA。
 
鉴别对于有效性安全性来说,这个指标确实是关键的,因此我们可以看成是一个CQA,但是这个鉴别项是通过只要体系进行有效的控制,有SSQ3质量体系控制的。第二方面在药品放行我们进行检测,质量检测首当其冲就是鉴别,因此它虽然是一个CQA,但是不大可能是处方和工艺的影响,因此我们可以不做风险评估深入的研究。
 
再比如说含量均匀度、溶出度、含量,与产品有关系因此做风险评估深入研究。
 
比如说水分,我们讲产品含水量可能导致微生物的增长可能是潜在的CQA,这个品种比较特殊,原
料药对水分不敏感,也不大影响产品的稳定性,因此水分这样的质量属性在这个品种里面不是CQA也不用进行风险评估质量研究,确定要不要风险评估质量研究,需要具体品种具体分析。
 
我们就把研发开始前QbD理念的应用,我们国内要学会这两个东西,怎么确定研发目标,怎么确定CQA。我们看研发过程当中的应用。一个围绕产品一个围绕工艺,它的开发,它的理解,它的核心将物料属性和工艺成熟与产品质量属性相关联,用的主要工具就是风险评估,因为风险与物料属性和工艺产品存在内在联系,我们看到研发过程QbD的理念应用,将与产品有关的变量和与工艺有关的变量,通过风险评估与产品的CQA相关联,来确定关键性,就是确定两个东西一个叫做CMA一个叫做CQA确定。
 
关键性是链条断裂风险最高的点,绳索断开风险最高的点,漏水风险最高的点,现在强制要求写第一个东西就是关键步骤,关键步骤里面的工艺参数给合理性给予说明,没有通过真正深入确定CMA和CPP。CMA将对产品有明显影响的物料属性,CPP是指有明显影响的工艺属性。CQA讲输出物料的关键特征,CMA讲输入物料的关键。这个互相会变,东西都是同样的东西,我们要学会如何寻找潜在的CMA、CPP,或者寻找高风险物料属性和参数,与CQA如何关联这个就是方法。
 
如果我们把混料确定为中间体的CQA的话,这样一个综合体的CQA成为下面压片的工序一个输入物料属性里面重要的CMA,这个是输入一个是输出。比如我们确定了混料属性是中混里面的CQA,如何寻找CMA,你以中间体的混料作为CQA思考,看哪一个与混料工艺性有明显影响,中混里面有很多,颗粒均匀性和混料均匀性有明显影响,可以看成潜在的CMA,或者高风险的物料属性,最后确定需要做风险评估,需要做深入研究。
 
寻找潜在的CPP跟刚才的例子一模一样的。对这个处方进行研究必须用到风险评估,风险识别,风险分析,风险评价。风险评估用到最重要的工具叫做FMEA。到底出了什么风险,什么地方出错误,我们在FMEA这个叫做FM。物料属性、工艺参数,这些东西对于产品质量属性有什么影响,这个叫做影响分析这个叫做EA,这就构成FMEA。因为这个方法能够很好的把物料属性工艺参数与产品的质量属性进行关联思考,来建立一种函数关系,因此FMEA方法在药学里面非常常用非常有效是这么说。这样一个风险评估工具,它的评估流程包括八个步骤,一个确定评估对象,刚才粉沫压片就是评估对象,然后对评估对象进行分析,然后进行失效模式及影响分析,这个基础上我们可以进行SPD分析,S就是严重度,P就是概率,风险发生可能性大小有多大,这个风险有多频繁,D就是可检测性,这个能不能预先发现提前预知,可以建立一定标准给SPD打分这个就是所谓的风险分析。把SPD相乘就得到一个综合分,风险优先数,英文叫做RPN,然后进行排序确定风险大小,合在一个是风险评价,这个风险做完了,风险评估做完以后我们看看要不要进行改进措施,然后我们把风险降低,这个就是风险控制,我们最终是为了控制风险。最后一步改进以后改进评估要进行更新,重新打分,SPD,RPN重新打分。
 
这个速释片我们进行SPD的标准,从S度来讲重新了偏差,但是不明显影响产品质量我们可以评为1分,这个严重度最低的,也出现了风险但是可以检查我们评为2分,引起少数产品部合格评为3分,导致停产这个是4分,最严重这个产品上市销售了需要招回,这个评为5分,这是对严重度S打分。
 
第二方面概率P我们打分,万分之一可能性我们认为不太可能,生产一万批最多有一批不合格,如果生产一百批大概一百年时间才有可能出现一次,这个发生可能性最小的,这个可以评为1分。千份之一的可能性,大概十年发生一次,评为2分,百分之一的可能性一年发生一次,十分之一叫做可能发生,大概一个月可能发生一次,这个发生可能性最高的是5分,是十分之一以内的可能性,这个叫做经常发生,大概不到一个月就可能发生一次差错,这个评为5分,这个是依据过去的经验,过去的数据对风险发生的可能性进行打分。
 
第三方面可检测性D打分,比如说在发行之前可以发现,这个可检测性最高分为1分,在过程中发生评为2分,在上市以后由客户发现这个可检测性更差可以评为5分,这个我们得到SPD的分数,三者相乘可以得到RPA,大于等于40分,不可接受,需要进一步研究以降低风险。20到39,可接受,可能徐进一步的研究。小于20分可以接受风险,无需要研究。
 
这样我们可以通过一个表格形式反映出你风险评估深入研究的过程,RPA、SPD等这样一些指标。
 
我们讲初始评估,粉沫制剂很简单,比如说混合,这个原料药密度分布主要影响溶出度,这个过大导致溶出度的下降,这时候确实有可能导致少数批次的产品不合格,因此严重度S我们可以评为3分。这样一个影响大概在不到一个月的时候就有可能发生一次,发生的可能性最高的,所以我们可以给P5分,需要到种产品检测可以发现,因此这个检测性不好这个D我们计为4分,这样RPA得到60分,按照刚才标准它属于一个高风险的因素。
 
再比如说讲压片主要影响溶出度,这个严重性比较高,有可能因为产品缺陷而停产,因此这个S可以计为4分,也是不到一个月的时候有可能发生一次,这个概率P最高可以计为5分,但是压片对溶出度影响在压片过程中就能发现,可检测性相对比较好,D可以得到2分,这个相乘得40分,这个分数虽然比较低,按照我们的标准这个仍然属于高风险的因素,因为时间关系其他我不讲了,我们通过初始风险评估,找到五个高风险的工艺属性物料参数,对这五个高风险采取改进措施。对于中风险,两个低风险混合剂的水平压片我们给一个范围这个初始风险评估就结束了。然后我们进行工艺开发和理解方面的活动。
 
比如说原料药的密度分布,我们研究4到45度凝结,经过体外溶出度研究,最后发现10到30度比较合适,超过30度已经不合适了。经过这样一个工艺开发理解,然后进行风险评估更新。风险评估更新以后发现原料药密度对溶出度的影响概率、可检测性没有改变,S是3分,P是5分,D是4分,RPA是60分,仍然是处于高风险。这是因为我们工艺开发理解的时候,混合的工序混合时间是固定的,混合上有一个转数每分钟斗筲转,这个是固定的,因此不作为控制高风险,因此还需要进一步采取改进的措施。
 
再比如说压片力对溶出度的影响,S还是4分,发生可能性从不到一个月发生一次的5分,变成了4分,只有很少量的提高,混合性略有降低,RPA变成32分,从高风险变成低风险,尽管如此发生可能性仍然很大,从不到一个月发生一次到一个月发生一次,5分变成4分这个仍然风险很大,这也需要进一步改进措施控制风险,虽然风险等级是中风险,中风险可能需要研究也可能不需要研究,这需要根据实际情况。这样一来就实施了两个在线控制的策略,在混合工序采用了叫做NIR的方法,通过控制连续光谱,达到一定效率的时候我就停止了,从5分变成了3分,大约一年发生一次,更重要可检测性大大提高,4分,可以预先控制,D变成了1分,这样RPA60降低9分,高风险降到了低风险。控制压片力,发生可能性从4分到2分,大约十年的时候发生一次,这个可能性也很小了,因此RPA从32分变成16分,中风险变成低风险,所有风险变成低风险达到可接受的程度,QbD的理念就是将风险评估和科学知识有机结合,就是与溶出度混合均匀度、含量均匀度等等产品的CQA关联思考,寻找确定CMA、CPP这样一个过程。最终找到原料药密度分布就是品种的CMA,压片力就是这个品种的CPP,然后我们可以控制策略,到商业化生产的时候实施控制策略。采用这样一个图更容易显示出QbD理念使用过程。
 
研发结束时控制策略的建立
 
研发结束的时候QbD理念应用建立控制策略,控制策略是一整套有计划的控制手段,主要包括物料属性,第二个工艺参数第三质量标准,还包括其他方面的内容。
 
比如说有一个速释片物料的控制,从原料药控制晶型,为了确保体外和体内的一致性,要保证充分的流动性,还有报纸批间的一致性,对于溶解剂和滑石粉也要控制,为了间接延迟溶出,用多溶出度会下降。
 
对于工艺策略也要控制,这个品种控制了压片速度,压片力,这个作为CPP控制,确保符合要求。对于过程控制做的很细,硬度、含度、总片重等等。
 
产品质量标准当然需要进行控制。我分享完了QbD理念在研发开始前,研发过程当中,研发结束的时候如何具体的应用,下面给一个小结。
 
上面三个阶段合在一起的时候可以认为基于QbD工艺设计的实施步骤,这个说明固体制剂的案例,这样一个工艺设计也是用于其他的制剂,原料药的工业,甚至方法设计,与这样一个实施步骤基本上相同的。大致上包括三个步骤,一个确定研发目标,比如说对于工艺设计来讲QTPP,对于分析方法验证来讲,方法设计来讲有一个分析目标概况,APP,这个国外已经很成熟了,第二确定产品的CQA,对于分析方法来讲就是确定方法关键性能特性。第三部就是找出所有可能影响产品或者工艺性能已知物料属性参数,对于分析方法来讲就是找材料的属性,我们试剂材料属性。我们找方法参数。第四步用科学知识风险评估确定高风险的属性或者参数。下面一步就是给它一个水平范围,就是研究的范围,要依据我们工作经验要给它选择好,然后可以进行方案设计和深入研究,结束以后可以分析数据,通过分析这些数据可以确定关键性的东西。
 
如果属性和参数的设计变化明显的影响输出的时候,这个属性一定是关键的,这个参数也是关键的,然后对风险评估进行更新,一次更新不够还有二次、三次更新。
 
最后一步建立合适的控制策略,CMA、CPP要定义可研究范围,这样我们控制策略最后可以控制好。
 
最后一方面我给今天分享做一个小结。有四个方面内容。
 
一个讲QbD是国际上最先进的控制模式,它的精髓集中体现在ICHQ8-QDD指导原则中。
 
第二可在研发的不同阶段适当加入一些QbD元素,研发目标QTPP、CQA、CMA、CPP和控制策略。
 
第三方面就是在研发的不同阶段适当采用一些QbD工具,风险评估和先前知识。
 
第四QbD在我国药品研发中的实际应用势在必行。比如说去年九月份国家审评中心有两个特殊表现,王亚伟老师带头灌输QbD的理念,第二他请一些一线研发人员,国内的博士,在会上介绍如何使用QbD的方法。因此国家局示范引导这样一个意图已经十分明显。惟有早做准备,做足准备,要不断的积累,厚积薄发,实现真正与国际接轨的中国梦!分为三个阶段,我们要学会应用QbD的名词图表的表达方式。第二我们慢慢学会应用QbD的理念,其次我们也有方法。第三是真正应用QbD的方法,最后与传统的方法结合使用,因为有一个道理QbD不排斥传统的方法,它完全可以结合在一起用的。另外一层意思就是把中国梦变成我的梦,变成我们每个人每天的行动,这样在座各位包括我自己就可以成为优秀的研发总监,谢谢大家!
 
注:本文为同写意论坛秘书处根据主讲嘉宾现场演讲内容整理 查看全部

 
鉴于QbD在我国药品研发中的应用势在必行,王兴旺博士以多个具体的研发实例告诉研发主管:可在研发的不同阶段适当加入一些QbD元素,如研发目标(QTPP)、CQA、CMA、CPP和控制策略;可在研发的不同阶段适当采用一些QbD工具,如风险评估和先前知识。
 
QbD的精髓
 
QbD的理念这个最早来自ESQM,QbD与Q9风险管理,Q10质量体系,Q11刚刚发布原料药研发,QE制剂研发。这样四到五个指导原则我们可以合在一起称之为QbD系列指导原则。所谓的QbD它的基本内容有几个名词,首先就是以预先设定一个叫做目标产品质量概况,确定一个产品的关键质量属性,简称CQA,这两个做好以后我们可以做评估,一个叫做CMA,第二就是CQA。与药品研发有关的QbD主要是涉及到工艺验证第一个工艺设计,第一阶段就是工艺设计概念。这里面包括三方面内容,一个围绕产品开发管理,第二围绕工艺开发理解,最后建立控制策略,在我们工艺设计。
 
QbD方法更强调产品理解,基于分析评估,要把CMA与CQA相关联,更强调工艺理解,基于风险评估,将CMA和CPP与产品的CQA相关联。它所建立的控制策略应该说是全面综合的。QbD的重要工具首当其冲是风险评估,第二是过程分析技术,第三DOE,这个我们国内基本上不做的。第四个模型模拟,下面先前知识与知识管理,还有质量体系。因此QbD是一个科学基于风险全面主动的指控模式。QbD的方法在国际上广泛应用于生产工艺的验证,从去年1月1号开始在美国申请仿制药,美国的FGA,已经强制要求工艺设计部分必须提交QbD的申报资料。
 
要说QbD的精髓可以从这样三个方面理解,一个方面可以认为这种现代的药品研发方法可以说成QbD方法,生命周期方法跟传统方法有所区别,最主要区别就是强调科学知识和风险评估的有机结合。
 
第二个方面可以把QbD认为是一种哲学,它遵循始与终的辩证统一,希望追求目标是自始至终,始终如一。比如说强调以终为始,强化研发目标,强调有始有终,突出过程控制,善始善终,注重持续改进,希望通过初始设计确保最终的质量,产品质量,分析方法质量,这是一种哲学。
 
第三个方面可以把QbD看成是一门艺术,实施产品工艺、分析方法的产品生命周期管理,所以QbD方法也叫做生命周期方法。
 
理念的具体应用
 
下面我们重点分享QbD的理念,如何在研发当中具体的应用。包括三个方面内容。
 
一个研发开始前,第二研发过程中,第三个研发结束的时候。我们看看QbD理念如何具体的应用。
 
先看第一方面研发开始前的应用,主要包括我刚才讲的两个方面,一个QTPP,一个是CQA,在研发工作开始之前我们必须明确。这个QTPP概念指产品质量属性前瞻性总结,但是这个产品质量属性可以认为是一个广义大概念。CQA是一个品种的物理、化学、生物学方面的性质和特征,这个必须控制在一个范围分布里面这个成为CQA了。
 
 QTPP确定的过程可以通过一张表的形式表现出来,包括要素、目标、合理性说明,比如说要素可以包括适应症、药品质量属性,比如讲中间的质量属性,成品的质量属性,药典对某一种剂型的规定等等。包装系统给予方式和说明书的一致性。最后一项可替代的给予方式,这里展现了QTPP确定的一个过程。这个值得注意的是给予方式与说明书的一致性,你看这个写了两个方面的内容,一个是有没有饮食禁忌,服用药片考虑不考虑食物影响,咖啡、饮酒要注意。如果是一个注射剂,比如讲有一个小水针需要吸收,这个时候给予方式与说明书的一致性要说清楚,你用的稀释溶剂到底是什么,用了多少量,在什么样条件下,这样一个稀释以后的溶剂在临床上能放多长时间,配合稳定性,使用稳定性的话题。
 
可代替的给药方式有也要说明,比如说分散片分散到温水里面给他服用,说明书有其他服用方法,比如讲放在口腔里面口嚼然后服用,这方面也要说清楚。
 
确定CQA可以通过这样一个说明书,主要是从药品的药效性、安全性的角度来看看它是不是这个产品的CQA,当然有可能是有可能不是,如果不能确定的时候需要进一步研究。如果是CQA以后还要进一步去看这个CQA是不是受到产品或者工艺的影响,如果是影响就是我们风险评估深入研究的对象,如果不受影响我们可以不做风险评估深入研究。
 
这里有一个CQA的确定过程,也可以通过一张表反映,列出产品质量属性、目标是否为CQA,是否需要风险评估深入研究,给予合理性的说明。比如说这样一个药片,可以包括外观形状、气味、尺寸大小,有刻痕。颜色和形状不直接与有效性发生关联因此它们都不是CQA。
 
鉴别对于有效性安全性来说,这个指标确实是关键的,因此我们可以看成是一个CQA,但是这个鉴别项是通过只要体系进行有效的控制,有SSQ3质量体系控制的。第二方面在药品放行我们进行检测,质量检测首当其冲就是鉴别,因此它虽然是一个CQA,但是不大可能是处方和工艺的影响,因此我们可以不做风险评估深入的研究。
 
再比如说含量均匀度、溶出度、含量,与产品有关系因此做风险评估深入研究。
 
比如说水分,我们讲产品含水量可能导致微生物的增长可能是潜在的CQA,这个品种比较特殊,原
料药对水分不敏感,也不大影响产品的稳定性,因此水分这样的质量属性在这个品种里面不是CQA也不用进行风险评估质量研究,确定要不要风险评估质量研究,需要具体品种具体分析。
 
我们就把研发开始前QbD理念的应用,我们国内要学会这两个东西,怎么确定研发目标,怎么确定CQA。我们看研发过程当中的应用。一个围绕产品一个围绕工艺,它的开发,它的理解,它的核心将物料属性和工艺成熟与产品质量属性相关联,用的主要工具就是风险评估,因为风险与物料属性和工艺产品存在内在联系,我们看到研发过程QbD的理念应用,将与产品有关的变量和与工艺有关的变量,通过风险评估与产品的CQA相关联,来确定关键性,就是确定两个东西一个叫做CMA一个叫做CQA确定。
 
关键性是链条断裂风险最高的点,绳索断开风险最高的点,漏水风险最高的点,现在强制要求写第一个东西就是关键步骤,关键步骤里面的工艺参数给合理性给予说明,没有通过真正深入确定CMA和CPP。CMA将对产品有明显影响的物料属性,CPP是指有明显影响的工艺属性。CQA讲输出物料的关键特征,CMA讲输入物料的关键。这个互相会变,东西都是同样的东西,我们要学会如何寻找潜在的CMA、CPP,或者寻找高风险物料属性和参数,与CQA如何关联这个就是方法。
 
如果我们把混料确定为中间体的CQA的话,这样一个综合体的CQA成为下面压片的工序一个输入物料属性里面重要的CMA,这个是输入一个是输出。比如我们确定了混料属性是中混里面的CQA,如何寻找CMA,你以中间体的混料作为CQA思考,看哪一个与混料工艺性有明显影响,中混里面有很多,颗粒均匀性和混料均匀性有明显影响,可以看成潜在的CMA,或者高风险的物料属性,最后确定需要做风险评估,需要做深入研究。
 
寻找潜在的CPP跟刚才的例子一模一样的。对这个处方进行研究必须用到风险评估,风险识别,风险分析,风险评价。风险评估用到最重要的工具叫做FMEA。到底出了什么风险,什么地方出错误,我们在FMEA这个叫做FM。物料属性、工艺参数,这些东西对于产品质量属性有什么影响,这个叫做影响分析这个叫做EA,这就构成FMEA。因为这个方法能够很好的把物料属性工艺参数与产品的质量属性进行关联思考,来建立一种函数关系,因此FMEA方法在药学里面非常常用非常有效是这么说。这样一个风险评估工具,它的评估流程包括八个步骤,一个确定评估对象,刚才粉沫压片就是评估对象,然后对评估对象进行分析,然后进行失效模式及影响分析,这个基础上我们可以进行SPD分析,S就是严重度,P就是概率,风险发生可能性大小有多大,这个风险有多频繁,D就是可检测性,这个能不能预先发现提前预知,可以建立一定标准给SPD打分这个就是所谓的风险分析。把SPD相乘就得到一个综合分,风险优先数,英文叫做RPN,然后进行排序确定风险大小,合在一个是风险评价,这个风险做完了,风险评估做完以后我们看看要不要进行改进措施,然后我们把风险降低,这个就是风险控制,我们最终是为了控制风险。最后一步改进以后改进评估要进行更新,重新打分,SPD,RPN重新打分。
 
这个速释片我们进行SPD的标准,从S度来讲重新了偏差,但是不明显影响产品质量我们可以评为1分,这个严重度最低的,也出现了风险但是可以检查我们评为2分,引起少数产品部合格评为3分,导致停产这个是4分,最严重这个产品上市销售了需要招回,这个评为5分,这是对严重度S打分。
 
第二方面概率P我们打分,万分之一可能性我们认为不太可能,生产一万批最多有一批不合格,如果生产一百批大概一百年时间才有可能出现一次,这个发生可能性最小的,这个可以评为1分。千份之一的可能性,大概十年发生一次,评为2分,百分之一的可能性一年发生一次,十分之一叫做可能发生,大概一个月可能发生一次,这个发生可能性最高的是5分,是十分之一以内的可能性,这个叫做经常发生,大概不到一个月就可能发生一次差错,这个评为5分,这个是依据过去的经验,过去的数据对风险发生的可能性进行打分。
 
第三方面可检测性D打分,比如说在发行之前可以发现,这个可检测性最高分为1分,在过程中发生评为2分,在上市以后由客户发现这个可检测性更差可以评为5分,这个我们得到SPD的分数,三者相乘可以得到RPA,大于等于40分,不可接受,需要进一步研究以降低风险。20到39,可接受,可能徐进一步的研究。小于20分可以接受风险,无需要研究。
 
这样我们可以通过一个表格形式反映出你风险评估深入研究的过程,RPA、SPD等这样一些指标。
 
我们讲初始评估,粉沫制剂很简单,比如说混合,这个原料药密度分布主要影响溶出度,这个过大导致溶出度的下降,这时候确实有可能导致少数批次的产品不合格,因此严重度S我们可以评为3分。这样一个影响大概在不到一个月的时候就有可能发生一次,发生的可能性最高的,所以我们可以给P5分,需要到种产品检测可以发现,因此这个检测性不好这个D我们计为4分,这样RPA得到60分,按照刚才标准它属于一个高风险的因素。
 
再比如说讲压片主要影响溶出度,这个严重性比较高,有可能因为产品缺陷而停产,因此这个S可以计为4分,也是不到一个月的时候有可能发生一次,这个概率P最高可以计为5分,但是压片对溶出度影响在压片过程中就能发现,可检测性相对比较好,D可以得到2分,这个相乘得40分,这个分数虽然比较低,按照我们的标准这个仍然属于高风险的因素,因为时间关系其他我不讲了,我们通过初始风险评估,找到五个高风险的工艺属性物料参数,对这五个高风险采取改进措施。对于中风险,两个低风险混合剂的水平压片我们给一个范围这个初始风险评估就结束了。然后我们进行工艺开发和理解方面的活动。
 
比如说原料药的密度分布,我们研究4到45度凝结,经过体外溶出度研究,最后发现10到30度比较合适,超过30度已经不合适了。经过这样一个工艺开发理解,然后进行风险评估更新。风险评估更新以后发现原料药密度对溶出度的影响概率、可检测性没有改变,S是3分,P是5分,D是4分,RPA是60分,仍然是处于高风险。这是因为我们工艺开发理解的时候,混合的工序混合时间是固定的,混合上有一个转数每分钟斗筲转,这个是固定的,因此不作为控制高风险,因此还需要进一步采取改进的措施。
 
再比如说压片力对溶出度的影响,S还是4分,发生可能性从不到一个月发生一次的5分,变成了4分,只有很少量的提高,混合性略有降低,RPA变成32分,从高风险变成低风险,尽管如此发生可能性仍然很大,从不到一个月发生一次到一个月发生一次,5分变成4分这个仍然风险很大,这也需要进一步改进措施控制风险,虽然风险等级是中风险,中风险可能需要研究也可能不需要研究,这需要根据实际情况。这样一来就实施了两个在线控制的策略,在混合工序采用了叫做NIR的方法,通过控制连续光谱,达到一定效率的时候我就停止了,从5分变成了3分,大约一年发生一次,更重要可检测性大大提高,4分,可以预先控制,D变成了1分,这样RPA60降低9分,高风险降到了低风险。控制压片力,发生可能性从4分到2分,大约十年的时候发生一次,这个可能性也很小了,因此RPA从32分变成16分,中风险变成低风险,所有风险变成低风险达到可接受的程度,QbD的理念就是将风险评估和科学知识有机结合,就是与溶出度混合均匀度、含量均匀度等等产品的CQA关联思考,寻找确定CMA、CPP这样一个过程。最终找到原料药密度分布就是品种的CMA,压片力就是这个品种的CPP,然后我们可以控制策略,到商业化生产的时候实施控制策略。采用这样一个图更容易显示出QbD理念使用过程。
 
研发结束时控制策略的建立
 
研发结束的时候QbD理念应用建立控制策略,控制策略是一整套有计划的控制手段,主要包括物料属性,第二个工艺参数第三质量标准,还包括其他方面的内容。
 
比如说有一个速释片物料的控制,从原料药控制晶型,为了确保体外和体内的一致性,要保证充分的流动性,还有报纸批间的一致性,对于溶解剂和滑石粉也要控制,为了间接延迟溶出,用多溶出度会下降。
 
对于工艺策略也要控制,这个品种控制了压片速度,压片力,这个作为CPP控制,确保符合要求。对于过程控制做的很细,硬度、含度、总片重等等。
 
产品质量标准当然需要进行控制。我分享完了QbD理念在研发开始前,研发过程当中,研发结束的时候如何具体的应用,下面给一个小结。
 
上面三个阶段合在一起的时候可以认为基于QbD工艺设计的实施步骤,这个说明固体制剂的案例,这样一个工艺设计也是用于其他的制剂,原料药的工业,甚至方法设计,与这样一个实施步骤基本上相同的。大致上包括三个步骤,一个确定研发目标,比如说对于工艺设计来讲QTPP,对于分析方法验证来讲,方法设计来讲有一个分析目标概况,APP,这个国外已经很成熟了,第二确定产品的CQA,对于分析方法来讲就是确定方法关键性能特性。第三部就是找出所有可能影响产品或者工艺性能已知物料属性参数,对于分析方法来讲就是找材料的属性,我们试剂材料属性。我们找方法参数。第四步用科学知识风险评估确定高风险的属性或者参数。下面一步就是给它一个水平范围,就是研究的范围,要依据我们工作经验要给它选择好,然后可以进行方案设计和深入研究,结束以后可以分析数据,通过分析这些数据可以确定关键性的东西。
 
如果属性和参数的设计变化明显的影响输出的时候,这个属性一定是关键的,这个参数也是关键的,然后对风险评估进行更新,一次更新不够还有二次、三次更新。
 
最后一步建立合适的控制策略,CMA、CPP要定义可研究范围,这样我们控制策略最后可以控制好。
 
最后一方面我给今天分享做一个小结。有四个方面内容。
 
一个讲QbD是国际上最先进的控制模式,它的精髓集中体现在ICHQ8-QDD指导原则中。
 
第二可在研发的不同阶段适当加入一些QbD元素,研发目标QTPP、CQA、CMA、CPP和控制策略。
 
第三方面就是在研发的不同阶段适当采用一些QbD工具,风险评估和先前知识。
 
第四QbD在我国药品研发中的实际应用势在必行。比如说去年九月份国家审评中心有两个特殊表现,王亚伟老师带头灌输QbD的理念,第二他请一些一线研发人员,国内的博士,在会上介绍如何使用QbD的方法。因此国家局示范引导这样一个意图已经十分明显。惟有早做准备,做足准备,要不断的积累,厚积薄发,实现真正与国际接轨的中国梦!分为三个阶段,我们要学会应用QbD的名词图表的表达方式。第二我们慢慢学会应用QbD的理念,其次我们也有方法。第三是真正应用QbD的方法,最后与传统的方法结合使用,因为有一个道理QbD不排斥传统的方法,它完全可以结合在一起用的。另外一层意思就是把中国梦变成我的梦,变成我们每个人每天的行动,这样在座各位包括我自己就可以成为优秀的研发总监,谢谢大家!
 
注:本文为同写意论坛秘书处根据主讲嘉宾现场演讲内容整理

如果你担心接种疫苗出问题,应该先看看这个

分享yang 回复了帖子 • 3 人关注 • 1 个回复 • 700 次浏览 • 2016-07-30 23:00 • 来自相关话题

狂犬病预防控制技术指南(2016 版)

专栏cnvax 发表了文章 • 0 个评论 • 216 次浏览 • 2016-05-06 20:29 • 来自相关话题

近期,由中国疾病预防控制中心办公室指定的《狂犬病预防控制技术指南(2016)》一文,发布在中国疾病预防控制中心官网,现整理如下,供广大医生参考学习。
摘要
狂犬病是由狂犬病病毒感染引起的一种动物源性传染临床大多表现为特异性恐风、恐水、咽肌痉挛、进行性瘫痪等。近年来,狂犬病报告死亡数一直位居我国法定报告传染病前列,给人民群众生命健康带来严重威胁。
为指导基层疾控机构做好狂犬病的预防控制工作,尤其是暴露后的预防处置,降低狂犬病所致死亡,中国疾病预防控制中心组织专家,参考世界卫生组织和美国疾控中心的技术指南,以及国内外最新研究进展,制定了《狂犬病预防控制技术指南(201 6 版)》。
本指南系统回顾了狂犬病的病原学、临床学、实验室诊断、流行病学、疫苗和被动免疫制剂的种类、机理、效果、安全性和不良反应监测与处置,以及暴露预防处置方法等内容的科学证据,在此基础上对狂犬病暴露前和暴露后预防处置的伤口处置、疫苗接种和被动免疫制剂使用等技术给出了推荐建议。
本指南适用于从事狂犬病防控工作的各级各类疾病预防控制机构、狂犬病暴露预防处置门诊、医疗机构感染科和急诊科等专业人员。根据狂犬病的国内外研究进展,本指南今后将不断更新、完善。
病原学和实验室诊断
1. 病原学
狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)属于单负病毒目(Mononegavirales)弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒属(Lyssavirus)。狂犬病病毒颗粒呈子弹状,长 100~300nm,直径约 75nm。病毒基因组长约 12kb,为不分节段的单股负链 RNA,从 3'到 5' 端依次编码 5 种结构蛋白,分别为核蛋白(Nucleoprotein,N)、磷蛋白(Phosphoprotein,P)、基质蛋白(Matrixprotein,M)、糖蛋白(Glycoprotein,G)和依赖 RNA 的 RNA 多聚酶(RNA dependent RNA polymerase or Large protein,L)。
病毒颗粒由囊膜(Envelope)和核衣壳(Nucleocapsid)两部分组成,基因组 RNA 及外层紧密盘绕的 N、P、L 蛋白共同构成具有转录、翻译功能的核衣壳;颗粒外层脂质膜表面镶嵌着 G 蛋白以三聚体构成的纤突 ( Spike),为病毒中和抗原及与宿主受体结合的部位,M 蛋白位于外壳内侧和核衣壳之间,连接内外两部分。
狂犬病病毒不耐高温,悬液中的病毒经 56 度 30~60 分钟或 100 度 2 分钟即失去感染力。脑组织内的狂犬病病毒在常温、自溶条件下,可保持活力 7~10 天,4 度 可保存 2~3 周。狂犬病病毒在 pH 7.2~8.0 较为稳定,超过 pH 8 易被灭活。狂犬病病毒对脂溶剂(肥皂水、氯仿、丙酮等)、乙醇、过氧化氢、高锰酸钾、碘制剂以及季铵类化合物(如苯扎溴铵)等敏感。1:500 稀释的季胺类消毒剂、45%~70% 乙醇、1% 肥皂水以及 5%~7% 碘溶液均可在 1 分钟内灭活病毒,但不易被来苏水溶液灭活。
不同型别狂犬病病毒的致病性不同:在犬、猫等哺乳动物中传播,也称「街毒」的狂犬病病毒毒力很强,感染后一旦出现临床症状,病死率几乎 100%,是世界上病死率最高的传染病;而在蝙蝠中传播的狂犬病病毒毒力相对较弱。
直到 20 世纪 50 年代,RABV 一直被认为是狂犬病的唯一病原。通过对来自尼日利亚的与 RABV 有血清学相关性的病毒即 LBV(Lagos bat virus)和 MOKV(Mokola virus)的鉴定,以及对(1970 年分离自南非被蝙蝠咬伤病人的 DUVV(Duvenhage virus)病毒的分析,发现了狂犬病病毒群的复杂性,由此出现了「狂犬病相关病毒(Rabies-related virus)」和「狂犬病血清型」的术语,目前分别将 RABV、LBV、MOKV、DUVV 确定为四种血清型。
1950 年以来在欧洲分离到的蝙蝠病毒与 DUVV 呈血清学相关性,应用单克隆抗体反应将欧洲蝙蝠病毒进一步分为 EBLV-1(European bat lyssavirus 1)和 EBLV-2(European bat lyssavirus 2)。
针对狂犬病相关病毒多样性的遗传进化研究,产生了新的专业术语「基因型」,并继续发现了新的基因型,如 1997 年从澳大利亚果蝠中分离到的 ABLV(Australian bat lyssavirus)确定为基因 7 型。
为了更好地对日益增多的狂犬病相关病毒进行归类,国际病毒分类委员会(International Committee of Taxonomy Virus,ICTV)主持设立了狂犬病病毒属,将现存的基因型作为狂犬病病毒分类的基础,并结合系统发生进化树的拓扑结构、单克隆抗体反应谱,以及生态、宿主、地理范围等特征确立了病毒种类。
2014 年,ICTV 最新分类结果明确了 14 种(Species)狂犬病病毒。
除了上述 7 个基因型代表 7 种不同的狂犬病病毒外,21 世纪新发现的另外 7 种病毒包括从中亚食虫蝙蝠中分离到的 KHUV(Khujand virus)和 ARAV(Aravan virus),从俄罗斯食虫蝙蝠中分离到的 IRKV(Irkut virus)和 WCBV(West Caucasian bat virus),从非洲肯尼亚食虫蝙蝠中分离到的 SHIBV(Shimoni bat virus),从法国、德国食虫蝙蝠中分离到的 BBLV(Bokeloh bat lyssavirus)和坦桑尼亚非洲灵猫身上分离到的 IKOV(Ikoma lyssavirus) 。
2011 年从西班牙蝙蝠中分离到的 LLEBV(Lleida bat lyssavirus)尚未经 ICTV 明确归类。
2. 实验室诊断
标本采集:病人发病后(死亡前)可采集其唾液(间隔 3~6 小时,至少采集 3 份)、脑脊液、血清及颈后带毛囊的小块皮肤;病人死后最好采集其脑组织标本(小脑和脑干)进行实验室检测。
直接免疫荧光法(Direct Fluorescent Antibody Test,DFA)是狂犬病诊断的金标准,可以快速、敏感、特异地检测人和动物脑组织中的病毒抗原。临床病例活体组织标本(如颈后部皮肤毛囊)亦可进行 DFA 检测。直接快速免疫组化法(Direct Rapid Immunohistochemical Test,DRIT)及酶联免疫吸附测定法(Enzyme-Iinked Immuno Sorbent Assay,ELISA)亦可特异检测狂犬病病毒抗原。
病毒核酸检测可用于早期诊断,以逆转录 PCR 法(Reverse  Transcription-PCR,  RT-PCR)(包括 Real-time RT-PCR)检测体液(唾液、血清等)和脑组织等标本,但需要严格的质量控制以保证结果的准确性。脑组织及唾液等病毒含量高的样本还可进行病毒分离。细胞培养分离所需时间(1~2 天)远少于小鼠颅内接种分离法所需时间(10~21 天),且前者的生物安全风险远小于后者。
未接种过疫苗的患者,发病早期几乎没有中和抗体产生,到发病晚期(通常在临床症状出现后 7-8 天),病毒在脑内大量增殖后突破血脑屏障进入血液,刺激机体产生低水平的中和抗体。通过病毒中和试验检测病人血清或脑脊液中的中和抗体,可作为狂犬病诊断的依据之 -。
世界卫生组织(Mrorld Health Organization,WHO)推荐的抗狂犬病病毒中和抗体标准检测方法包括快速荧光灶抑制试验 ( Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test.RFFIT)和小鼠脑内中和试验(Mouse Neutralization Test,MNT)。
由于 RFFIT 法无需使用小鼠,所用时间短(24 小时),目前已被广泛采用。RFFIT 方法也是我国现行药典规定的检测狂犬病病毒中和抗体的标准方法之一。
此外,常用的狂犬病病毒中和抗体检测方法还有荧光抗体病毒中和试验(Fluorescent AntibodyVirus Neutralization Test, FAVNT)。用 ELISA 法测定的抗狂犬病病毒糖蛋白抗体滴度与用病毒中和试验测定的结果有一定的相关性(约 80% 符合率),但相应试剂盒尚未普及。
此外,还可以通过检测中和抗体,监测暴露前抗体背景及暴露后疫苗注射的免疫效果。WHO 狂犬病专家咨询委员会认为:中和抗体水平等于或高于 0.5IU/ml 时,接种者才具备了有效的保护能力;如果发现中和抗体水平低于 0.5IU/ml,应进行加强免疫,至达到有效保护水平为止。
临床学
1. 发病机理
大多数人间狂犬病病例是由于被患狂犬病的动物咬伤所致,少数是由于被抓挠或伤口、粘膜被污染所致,因移植狂犬病患者捐赠的器官或组织发病也偶有报道,但病毒不能侵入没有损伤的皮肤。
嗜神经性是狂犬病病毒自然感染的主要特征,病毒的复制几乎只限于神经元内。病毒最初进入伤口时,不进入血液循环(通常在血液中检测不到狂犬病病毒),而是在被咬伤的肌肉组织中复制,然后通过运动神经元的终板和轴突侵入 外周神经系统。
在一些蝙蝠变异株中,由于嗜皮肤性,病毒增殖也可以发生在感觉神经。病毒进入外周神经后,以运输小泡为载体,沿轴突以逆轴浆运动的方向向中枢神经系统「向心性」移行,而不被感觉或交感神经末梢摄取。其移行速度取决于转运方式,逆向轴突运输速度较快,可达 5~100 mm/ 天,如一定范围内(如 10μm 至 2 cm)的突触同时受感染,病毒移行速度甚至会更快。
病毒在轴突移行期间不发生增殖,当到达背根神经节后,病毒即在其内大量增殖,然后侵入脊髓和整个中枢神经系统。动物实验发现,狂犬病病毒从脊髓上行到脑的扩散速度非常迅速,一旦侵入脑则迅速增殖,脑干最先受累,也是感染最重的区域。
在中枢神经系统中增殖后,病毒通过在运动轴突的顺向轴浆运输「离心性」扩散进入腹侧根、被根神经节及其感觉轴突,并感染感觉轴突支配的肌梭、皮肤、毛囊及其他非神经组织,主要累及神经丛和唾液腺腺泡细胞,并经唾液腺排放到唾液中,再由咬伤伤口或被带毒唾液污染的粘膜传播到下一个受害者。
在感染末期,心、胰腺、肾上腺和胃肠道等神经外组织也同时受累。临床发病时,病毒已广泛分布于中枢神经系统及神经外的器官中。
人间狂犬病潜伏期从 5 天至数年(通常 2~3 个月,极少超过 1 年),潜伏期长短与病毒的毒力、侵入部位的神经分布等因素相关。病毒数量越多、毒力越强、侵入部位神经越丰富、越靠近中枢神经系统,潜伏期就越短。
此外,肌肉特异性小 RNA 可能通过抑制病毒在肌肉中的转录和复制影响潜伏期。狂犬病实验感染动物(如犬)的最长潜伏期为半年。在潜伏期内,病毒主要存在于外周肌肉或神经细胞中。
包括人类在内的多种哺乳动物感染狂犬病病毒后,随着病毒在中枢神经系统的扩散,均可引起严重的进行性脑、脊髓、脊神经根炎,病毒数量与临床症状的严重程度无关。人类的临床表现可分为狂躁型和麻痹型两种,临床分型可能与病毒对神经组织不同位点的特异性反应有关,而与病毒在中枢神经系统内的解剖定位无关。
电生理学研究发现,麻痹型狂犬病的虚弱症状与外周神经轴突病变或者脑白质变性有关。病毒首先侵入运动神经元解释了狂躁型狂犬病人亚临床的前角细胞功能失调要早于感觉消失症状的出现,并且症状首先发生在被咬伤部位附近,再逐渐发展到身体其他部位。同样的解释也适用于麻痹型狂犬病人的前驱症状和体征。
犬类麻痹型狂犬病的核磁弥散张量成像显示,脑干部位神经束的完整性受损,限制了病毒向前脑的传播。病毒的免疫逃避策略加之血脑屏障的完整性阻碍了中枢神经系统中病毒的清除。目前尚无狂犬病病人因免疫抑制或加强而死亡的证据。
如无重症监护,病人会在出现神经系统症状后 1~5 天内死亡。目前对狂犬病导致死亡的病理生理学尚未阐明。尽管脑、脊髓、脊神经根的炎症广泛分布,但并没有破坏神经组织结构。死因可能是由于控制循环和呼吸系统的中枢神经系统受累或功能障碍。
1. 临床表现与诊断标准
(1)狂犬病暴露者的伤口感染对于狂犬病暴露者而言,除了罹患狂犬病的风险外,动物咬伤还可以导致各种复杂的外科伤口、可能的严重并发症以及继发的细菌感染。致伤动物不同,所导致的伤口类型、临床特点以及预后均有所不同。
例如,普通外科创伤的伤口感染率通常为 5%~7%,而在 III 级暴露中,犬咬伤伤口大部分为撕裂伤(约 60%~76.5%),而猫咬伤大部分为穿刺伤(约 85.3%);犬咬伤伤口平均感染率约 14.8%,而猫咬伤约为 26.8%;手、足部位的咬伤伤口感染率明显较其他部位要高;犬咬伤容易引起化脓性软组织感染,而猫咬伤容易引起淋巴管 / 淋巴结炎、丹毒等。
引起咬伤伤口感染的细菌主要来源于动物口腔,48% 的犬咬伤和 63% 的猫咬伤感染伤口分离出需氧和厌氧菌混合感染,犬咬伤感染伤口分离出的主要细菌是犬属巴斯菌属,而出血败血型巴斯菌属是猫咬伤感染伤口内最主要的菌种。灵长类咬伤感染伤口内分离的菌种包括嗜血杆菌、核粒梭形菌、微小消化链球菌、放线菌属、产碱杆菌和直肠沃林氏菌(拟杆菌属)。
猪咬伤伤口分离出的菌种主要包括猪放线菌、拟杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、多杀性巴斯杆菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌(耐甲氧西林 MRSA)等。巴斯菌属、链球菌、葡萄球菌、摩拉克菌和奈瑟菌属是最常见的需氧菌;梭形杆菌属、拟杆菌属、噬卟啉拟杆菌属是最常见的厌氧菌,且其中大部分细菌为产 β- 内酰胺酶,甚至是耐甲氧西林的菌种(MRSA),因此,在伤口感染或预防性使用抗生素时,需考虑病原菌耐药因素。
(2)狂犬病的临床表现
狂犬病在临床上可表现为狂躁型(大约 2/3 的病例)或麻痹型。由犬传播的狂犬病一般表现为狂躁型,而吸血蝙蝠传播的狂犬病一般表现为麻痹型。
狂躁型患者以意识模糊、恐惧痉挛,以及自主神经功能障碍(如瞳孔散大和唾液分泌过多等)为主要特点。麻痹型患者意识清楚,但有与吉兰一巴雷综合征(Guillain-Barre Syndrome,GBS)相似的神经病变症状。GBS 是脊神经和周围神经的脱髓鞘疾病,又称急性特发性多神经炎或对称性多神经根炎,临床主要表现为进行性、上升性、对称性麻痹,四肢软瘫,以及不同程度的感觉障碍。
与 GBS 不同的是,狂犬病患者一般伴有高热、叩诊肌群水肿(通常在胸部、三角肌和大腿)和尿失禁,而不伴有感觉功能受损。
根据病程,狂犬病的临床表现可分为潜伏期、前驱期、急性神经症状期(兴奋期)、麻痹期、昏迷和死亡几个阶段。但实际上发病是一个连续的临床过程,而不是简单的一系列可以独立分割的表现。
a.   潜伏期:从暴露到发病前无任何症状的时期,一般为 1~3 个月,极少数短至两周以内或长至一年以上,此时期内无任何诊断方法。
. 前驱期:患者出现临床症状的早期,通常以不适、厌食、疲劳、头痛和发热等不典型症状开始,50%~80% 的患者会在原暴露部位出现特异性神经性疼痛或感觉异常(如痒、麻及蚁行感等),可能是由于病毒在背根神经节复制或神经节神经炎所致。此时期还可能出现无端的恐惧、焦虑、激动、易怒、神经过敏、失眠或抑郁等症状。前驱期一般为 2~10 天(通常 2~4 天)。
c. 急性神经症状期:患者出现典型的狂犬病临床症状,有两种表现,即狂躁型与麻痹型。
狂躁型患者出现发热并伴随明显的神经系统体征,包括机能亢进、定向力障碍、幻觉、痉挛发作、行为古怪、颈项强直等。其突出表现为极度恐惧、恐水、怕风、发作性咽肌痉挛、呼吸困难、排尿排便困难及多汗流涎等。
恐水、怕风是本病的特殊症状,典型患者见水、闻流水声、饮水或仅提及饮水时,均可引起严重的咽喉肌痉挛。患者虽渴极而不敢饮,即使饮后也无法下咽,常伴声嘶及脱水。亮光、噪声、触动或气流也可能引发痉挛,严重发作时尚可出现全身疼痛性抽搐。由于常有呼吸肌痉挛,故可导致呼吸困难及发绀。
大多数动物狂犬病病例的机能亢进期会持续数小时至数天,人间狂犬病病例的机能亢进为间歇性,由数个持续 1~5 分钟的兴奋期组成。患者的神志大多清楚,亢进期之间,患者一般合作,并可以进行交流。急性神经症状期的其他异常表现包括肌束震颤(尤其是暴露部位附近)、换气过度、唾液分泌过多、局部或全身痉挛,以及一些较罕见的症状,包括阴茎异常勃起或性欲增强,这些体征都与自主神经功能障碍有关。本期一般持续 1~3 天。
麻痹型患者无典型的兴奋期及恐水现象,而以高热、头痛、呕吐、咬伤处疼痛开始,继而出现肢体软弱、腹胀、共济失调、肌肉瘫痪、大小便失禁等,呈现横断性脊髓炎或上升性脊髓麻痹等类 GBS 表现。其病变仅局限于脊髓和延髓,而不累及脑干或更高部位的中枢神经系统。
d. 麻痹期:指的是患者在急性神经症状期过后,逐渐进入安静状态的时期,此时痉挛停止,患者渐趋安静,出现弛缓性瘫痪,尤以肢体软瘫最为多见。麻痹可能是对称性或非对称性的,以被咬肢体侧更为严重;或者呈上升性,类似 GBS。
眼肌、颜面部肌肉及咀嚼肌也可受累,表现为斜视、眼球运动失调、下颌下坠、口不能闭、面部缺少表情等。进而患者的呼吸渐趋微弱或不规则,并可出现潮式呼吸;脉搏细数、血压下降、反射消失、瞳孔散大。临终前患者多进入昏迷状态,呼吸骤停一般在昏迷后不久即发生。本期持续 6~18 小时。
狂犬病的整个自然病程一般不超过 5 日。死因通常为咽肌痉挛而窒息或呼吸循环衰竭。本病在临床上需与破伤风、病毒性脑膜脑炎、脊髓灰质炎、GBS 等相鉴别。
(3)诊断标准
原国家卫生部 2008 年颁布的狂犬病诊断标准:
根据患者的流行病学、临床表现和实验室检查结果进行综合判断,病例确诊需要实验室证据。
a. 临床诊断病例
符合下列任一项即可诊断:典型的狂躁型狂犬病临床表现;明确的动物致伤史 + 典型的麻痹型狂犬病临床表现。    
. 确诊病例
临床诊断病例加下列任一项,即可确诊:直接荧光抗体法(或 ELISA 法):检测患者唾液、脑脊液或颈后带毛囊的皮肤组织标本中狂犬病病毒抗原阳性,或用 RT-PCR 检测狂犬病病毒核酸阳性;细胞培养方法:从患者唾液或脑脊液等标本中分离出狂犬病病毒;脑组织检测:尸检脑组织标本,用直接荧光抗体法或 ELISA 法检测狂犬病病毒抗原阳性、RT-PCR 检测狂犬病病毒核酸阳性、细胞培养方法分离出狂犬病病毒。
c. WHO 的狂犬病定义
临床病例:病例具有急性神经性综合征(如脑炎),主要表现为机能亢奋(如狂躁型狂犬病)或者麻痹综合征(如麻痹型狂犬病),如果没有重症监护支持,病人通常会在首发症状出现后 7-11 天内进行性发展为昏迷和死亡,常见死因为呼吸循环衰竭。
符合下列实验室标准中的 1 种或几种即可确诊:
存在病毒抗原;细胞培养方法或实验动物接种中分离到病毒;未接种疫苗者的脑脊液或血清中存在病毒特异性抗体;通过分子生物学方法在活体或尸检样本(如脑活检样本、皮肤、唾液、浓缩尿)中检测到病毒核酸。
WHO 的狂犬病病例分类如下:
疑似病例:符合临床病例定义的病例;
可能病例:疑似病例,同时具有与疑似狂犬病动物接触的可靠病史;
确诊病例:实验室确认的疑似病例或可能病例。
在缺少动物暴露史或临床疑似脑炎症状的情况下,如果实验室诊断检测明确,仍可进行确定性诊断。对可能感染狂犬病的患者在采取适当预防措施情况下进行核磁共振成像检查可能有助于诊断。
无论临床类型如何,当脑干、海马、下丘脑、深层和皮层下白质以及深层和皮质灰质的核磁共振 T2 成像出现模糊、微弱的异常高信号时,均提示可能为狂犬病。疾病晚期,当患者进入昏迷状态时,增强核磁可以清楚地显示上述改变,这些特征可用来将狂犬病与其它病毒性脑炎相区别。脑部 CT 几乎没有诊断价值。
流行病学
1. 疾病负担
狂犬病在全球广泛分布,除南极洲外,所有大陆均有人间狂犬病报告。进入 21 世纪后,狂犬病仍然是重要的公共卫生威胁,全球每年约有 60000 人死于狂犬病,是致死人数最多的动物源性传染病,每年由此引发的经济负担约为 40 亿美元。
目前,除许多太平洋岛国无狂犬病报告外,仅有澳大利亚消除了肉食动物狂犬病,西欧、加拿大、美国、日本、马来西亚和少数拉丁美洲国家消除了犬狂犬病。
目前,99% 的人间狂犬病发生在发展中国家,主要分布在亚洲、非洲和拉丁美洲及加勒比海地区。亚洲的狂犬病病例数居全球首位,估计年死亡人数达 30000 人(95%CI,8100~61400)。印度为当前狂犬病疫情最严重的国家,据估计年狂犬病发病数为 2 万~3 万例,发病率为 2/10 万。
中国人间狂犬病发病仅次于印度,2007 年疫情高峰时,年报告病例数达 3300 例。2004~2014 年,狂犬病死亡人数一直高居我国传染病死亡数的前 3 位。此外,调查显示,部分地区狂犬病漏报率可能高达 35%,提示我国狂犬病的疾病负担可能存在低估。
2. 感染动物来源
狂犬病在自然界的储存宿主动物包括食肉目动物和翼手目动物,狐、狼、豺、鼬獾、貉、臭鼬、浣熊、猫鼬和蝙蝠等也是狂犬病的自然储存宿主,均可感染狂犬病病毒成为传染源,进而感染猪、牛、羊和马等家畜。狂犬病易感动物主要包括犬科、猫科及翼手目动物,禽类、鱼类、昆虫、蜥蛎、龟和蛇等不感染和传播狂犬病病毒。
全球范围内,99% 的人间狂犬病是由犬引起,特别是亚洲、非洲等狂犬病流行区,犬是引起人间狂犬病的最主要原因。而犬狂犬病疫情控制较好的欧洲、北美、澳大利亚及部分拉丁美洲国家的传染源为蝙蝠、狐、豺、狨猴、猫鼬和浣熊等野生动物。
宿主动物中,蝙蝠较为特殊,由于蝙蝠暴露可能为极难察觉的细微咬伤或损伤,从而导致暴露风险大为提高。WHO 及美国 CDC(Centers for Disease Control)均将蝙蝠暴露归类为严重暴露,要求将其按照 III 级暴露进行处置。
美国和加拿大 1950~2007 年间 56 例蝙蝠导致的人间狂犬病病例中,有明确咬伤史者仅 22 例(39%);与蝙蝠直接接触而无咬伤(如触摸蝙蝠)者 9 例(16%);有 6 例(11%)并无明确接触史,仅发现房间内有蝙蝠;而无直接接触者为 19 例(34%)。
WHO 指出,对北美洲和欧洲狂犬病流行地区的野生和家栖啮齿类动物的大规模检测显示,此类动物极少感染狂犬病,狂犬病病毒终端溢出性感染仅为偶发事件,说明此类动物并非狂犬病的贮存宿主,也不参与该疾病的流行和传播。
美国 CDC 也指出,啮齿类(尤其小型啮齿类,如:花栗鼠、松鼠、小鼠、大鼠、豚鼠、沙鼠、仓鼠)和兔形目(包括家兔和野兔)极少感染狂犬病,也未发现此类动物导致人间狂犬病的证据。根据美国 20 年(1985-2004 年)的监测,尽管在浣熊狂犬病发病地区,偶有旱獭(土拨鼠)感染狂犬病的记录,但从未在小型啮齿动物中检测到狂犬病病毒,也无啮齿类或兔形目动物导致人间狂犬病病例的证据。
3. 我国狂犬病流行特征
20 世纪 50 年代以来,我国狂犬病先后出现了 3 次流行高峰。第一次高峰出现在 20 世纪 50 年代中期,年报告死亡数曾逾 1900 人。第二次高峰出现在 20 世纪 80 年代初期,1981 年全国狂犬病报告死亡 7037 人,为新中国成立以来报告死亡数最高的年份。
整个 80 年代,全国狂犬病疫情在高位波动,年报告死亡数均在 4000 人以上,年均报告死亡数达 5537 人。第三次高峰出现在 21 世纪初期,狂犬病疫情在连续 8 年快速下降后,重新出现快速增长趋势,至 2007 年达到高峰,当年全国报告死亡数达 3300 人。
在第三次疫情高峰前后,我国采取了一系列遏制狂犬病的措施,包括落实狂犬病防控措施、建立狂犬病多部门防控机制、强化犬只管理和动物狂犬病防治,以及加强人用狂犬病疫苗和被动免疫制剂质量监管等,取得了较为显著的防治效果。自 2008 年起,我国狂犬病疫情出现持续回落,至 2014 年报告发病数已降至 1000 例以下,较 2007 年的峰值下降了 72%。
历史上我国所有省份均报告过狂犬病病例。近年狂犬病疫情主要分布在人口稠密的华南、西南、华东地区,但其他省份也时有疫情报告。1996~2008 年,除西藏和青海外,其余 29 省均有狂犬病病例报告,报告病例数排名前 10 位的省份为广西、湖南、贵州、广东、江西、江苏、湖北、河南、四川和安徽,报告病例占全国总数的 86.9%。   
2007 年以来,狂犬病波及地区数呈下降趋势,但速度相对缓慢。2007 年全国 23 省共 993 个县(区)报告病例,2014 年仍有 567 个县(区)报告病例。2007 年后,多数省份狂犬病疫情呈下降趋势,特别是疫情较重的省份下降显著,但疫情有向北和向西北地区扩展的趋势,河北、山西、云南、陕西、海南、重庆等既往报告发病数较少的省份曾一度出现疫情上升。2012 年后,各省疫情均呈持续下降趋势。
我国每个月均有狂犬病病例报告,夏秋季高发,发病高峰一般出现在 8 月。2005~2011 年监测数据分析显示,不同地区的季节性特征存在差异,纬度越高季节性越明显,病例发病的时间相对集中。
病例呈现「三多」的特征:农村地区病例较多,农民一般占病例总数的 65% 以上;男性病例数约为女性的 2 倍;15 岁以下儿童和 50 岁以上人群发病较多,1996~2008 年近 25% 的病例为 15 岁以下儿童。
病例主要由犬伤所致,约占 90% 左右;其次为猫,占 5% 左右,其他致伤动物包括马、松鼠、猪、蝙蝠、猴和獾等,但较为少见,仅占不到 5%。约 50% 伤人动物为家养,其中绝大多数家养动物未接种动物狂犬病疫苗,流浪动物约占伤人动物总数的 25%。
根据我国人用狂犬病疫苗的使用量,估计全国年暴露人口数逾 4000 万。部分狂犬病高发省份的监测显示,90% 以上的暴露就诊人群为 II 级和 III 级暴露,其中 III 级暴露约 40%。全部暴露者中,约 10% 未全程接种疫苗;III 级暴露者中,仅 15% 左右接受被动免疫制剂注射。绝大多数病例由狂犬病病毒街毒感染所致,但也有少量由狂犬病毒属相关病毒感染致病的报道。
人用狂犬病疫苗
1. 人用狂犬病疫苗的历史和现状
1882 年,法国人路易巴斯德先生首次成功发明了人用狂犬病疫苗,之后经历了早期的动物神经组织疫苗、禽胚疫苗、细胞培养的粗制疫苗,发展到目前技术日趋完善的原代地鼠肾细胞、鸡胚细胞、人二倍体细胞和 Vero 细胞培养的纯化疫苗。
早期的神经组织疫苗免疫效果不佳(全程免疫后仍有 1‰  的死亡病例),且疫苗接种后局部和全身反应严重,由于疫苗中含有动物脑组织的髓磷脂成分,接种后可能引起神经性麻痹反应(变态反应性脑脊髓炎)。WHO 于 1984 年建议停止生产和使用神经组织疫苗,目前各国已陆续停止使用。
20 世纪 60 年代起,采用细胞和组织胚胎培养技术生产的狂犬病疫苗(Cell Culture and Embryonated Egg-based Rabies Vaccines,CCEEVs)取得了长足发展。由于采用了细胞培养和纯化技术,CCEEVs 避免了产品中残留动物脑组织、细胞蛋白残留等引起的不良反应,提高了疫苗效价和免疫后抗体水平,减少了注射针次,最大限度降低了免疫失败病例。
现已证明,CCEEVs 可安全有效地预防狂犬病。目前广泛使用的有 Vero 细胞纯化疫苗、人二倍体细胞疫苗、纯化鸡胚细胞疫苗和原代地鼠肾细胞疫苗等。
人二倍体细胞疫苗(Human Diploid Cell Rabies Vaccine,HDCV)为美国 Wistar 研究所首创,随后法国 Merieux 研究所 1974 年获得生产许可,经多中心临床人体观察,该疫苗接种后不良反应发生率低、症状轻,免疫效果好。但是人二倍体细胞增殖慢、病毒产量低、疫苗成本高、价格贵、尚不能得到广泛应用。
纯化 Vero 细胞狂犬病疫苗由法国 Merieux 研究所于 1985 年获得生产许可,人体观察不良反应轻、效果好,与人二倍体细胞疫苗有着同样的安全性和效力。而且由于培养的狂犬病病毒滴度高、疫苗产量大、价格低,在世界范围得到了广泛的应用。
纯化鸡胚细胞疫苗和原代地鼠肾细胞疫苗根据不同厂家的临床观察,其不良反应较轻微,免疫效果、安全性和有效性均较好。
现代生物技术的发展为新型疫苗的研究提供了更多可能性,比如重组疫苗、DNA(Deoxyribonucleic acid)疫苗、多肽疫苗等。但是与纯化细胞疫苗相比,大部分没有优势,个别重组疫苗已应用于野生动物,但目前在人体的研究进展不明。例如,临床实验结果显示,含有狂犬病 G 蛋白的痘苗和金丝雀痘病毒载体疫苗接种 2 剂可产生中和抗体,但抗体水平低于人二倍体细胞疫苗。
2. 我国人用狂犬病疫苗的历史和现状
1980 年以前,我国一直生产和使用羊脑制备的经石炭酸灭活的脑组织疫苗。
1965 年,我国开始研制原代地鼠肾细胞培养的原液灭活疫苗,此疫苗须加入氢氧化铝(AI(OH)3)作为佐剂以增加疫苗效力,1980 年获生产许可证书,当时以 Habel 法测定疫苗效力,要求保护指数 ≥ 1 0000,需皮下注射 14 针;后改用 NIH 法测定效价,效价定为 1.3IU/2 ml,免疫程序也改为 5 针法。
Fangtao Lin 的研究显示,该疫苗注射后抗体水平高于羊脑疫苗,对确诊为狂犬病的动物致伤的暴露者有保护作用。由于新疫苗效价仍较低且免疫失败病例频发,卫生部决定改进疫苗生产工艺,将疫苗培养的病毒原液超滤浓缩 3~5 倍以提高疫苗中抗原含量,使加入氢氧化铝佐剂后的疫苗效价能达到 ≥ 2.5IU 的标准。
然而,单纯浓缩疫苗在提高效力的同时,由于杂质蛋白残留物含量相应增高,不良反应发生率升高且症状加重,严重不良反应发生率达 5%~10%。此后,为改进疫苗的质量特性,引入柱层析等纯化技术去除杂质蛋白,疫苗仍然添加氢氧化铝佐剂,NIH 法检测效价可达 2.5IU 以上,达到了 WHO 设定的疫苗有效标准。
使用 WHO 推荐的通用的暴露前「3 针法」和暴露后「5 针法」,尽管添加氢氧化铝佐剂可以增加免疫效果,但会导致机体免疫应答缓慢,产生中和抗体延迟。由于狂犬病疫苗主要用于暴露后免疫,疫苗诱导免疫的时效性非常重要。
2005 年,国家食品药品监督管理局要求去除氢氧化铝佐剂。临床研究显示,去佐剂疫苗的早期免疫反应明显高于佐剂疫苗,初次免疫 14 天中和抗体阳转率可达 100%,且不良反应发生率低。1990 年以来,我国研制或引进 Vero 细胞为基质的纯化狂犬病疫苗大量上市,2014 年,国产人二倍体细胞疫苗也批准上市,疫苗种类不断增多,我国目前批准上市的人用狂犬病疫苗种类见表 1。

3. 人用狂犬病疫苗免疫程序的演变
人类最早由路易巴斯德应用感染狂犬病病毒的干燥兔脊髓悬液的减毒活病毒尝试预防狂犬病,连续注射 13 针而获得成功。之后研发的灭活神经组织疫苗需连续接种 14~21 针。随着细胞培养疫苗的出现,疫苗的免疫原性有了较大提高,通过实验不同免疫针次和间隔时间进行抗体应答比较,
对于效价高于 2.5IU/ 剂的细胞培养疫苗可采用简化的接种程序,欧洲率先采用 0、3、7、14、28、90 天注射的 6 针接种程序。随着研究数据的积累发现第 6 针疫苗的接种并不能显著提高抗体水平,所以改为根据受种者机体的具体情况决定是否接种第 6 针,一般情况下仅需要接种 5 针。之后,「5 针法」被 WHO 推荐且目前仍在全球广泛应用。
1984 年,前南斯拉夫的 Zagreb 公共卫生研究院针对不同种类狂犬病疫苗进行不同间隔接种的免疫程序及优化接种程序的探索研究,结果显示,于 0 天左右上臂三角肌各接种 1 剂,7、21 天再分别接种 1 剂的免疫程序所产生的中和抗体时间较早,且水平也较高,此免疫程序被称为「2-1-1」程序。1992 年 WHO 在狂犬病专家委员会第八次会议中正式推荐应用。
美国免疫实施顾问委员会(AdvisoryCommittee on Immunization Practices,ACIP)于 2009 年在综合已发表文献的基础上,建议健康成年人在规范处置的情况下,可采取原 5 针免疫程序减少最后 1 针的方法,即在 0、3、7、14 天注射的「简易 4 针法」免疫程序。
目前,WHO 推荐的暴露后免疫肌内注射程序包括「5 针法」(Essen 法)、「2-1-1」程序(Zagreb 法)以及 ACIP 推荐的「简易 4 针法」。推荐的暴露前免疫肌内注射方案为 3 剂疫苗,分别在 0、7 和 21 或 28 天接种。我国批准上市的狂犬病疫苗的暴露后免疫程序包括「5 针法」和「2-1-1」程序两种,各疫苗的免疫程序以国家食品药品监督管理总局批准的疫苗使用说明书为准。
4. 人用狂犬病疫苗的免疫机制、毒株及质量标准
狂犬病病毒 RNA 编码核蛋白(N)、M1、M2、病毒包膜糖蛋白(G)和 L 五种蛋白,其中 G 蛋白是狂犬病病毒最主要的抗原,可有效刺激特异性辅助性 T 细胞(helper T,Th)和细胞毒性 T 细胞(Cytotoxic lymphocyte,CTL)增生,并诱导机体产生特异性抗体。
G 蛋白特异性抗体是狂犬病疫苗最重要的保护性抗体,免疫效果主要依赖其抗原表位、结构、蛋白折叠及糖基化等。N 蛋白也是一种有效的保护性抗原,能够刺激 B 细胞和 Th 细胞诱导产生细胞和体液免疫。
磷蛋白(P)可诱导 CTL,但保护作用较弱。机体在接种狂犬病疫苗约 7 天左右产生 IgM(Immunoglobulin M)抗体,在约 14 天后产生 IgG(Immunoglobulin G)抗体并迅速升高。
IgM 和 IgG 抗体均具有中和病毒的能力,有些中和抗体能进入感染狂犬病病毒的神经细胞内抑制病毒复制。CTL 的高峰出现在免疫后 12 天,可清除中枢神经系统内的狂犬病病毒,Th 细胞可增强抗核蛋白和糖蛋白抗体,也能增加保护效果。但 Suss 的研究认为细胞免疫在狂犬病中的作用不明。
由于狂犬病病毒核蛋白序列高度保守,氨基酸同源性达 78% 至 93%,故病毒之间在核壳体水平上存在着广泛的抗原交叉反应。狂犬病病毒的主要抗原部位为 G 蛋白外功能区,当其氨基酸同源性 >74% 时,病毒之间能够交叉中和,为同一遗传谱系内的病毒;膜外区的氨基酸同源性 <62% 时,则无交叉中和反应。目前疫苗株均属于遗传谱系 I,对遗传谱系 II 中的病毒感染不具保护作用。
现已经有十余个种类或基因型的狂犬病病毒属病毒被描述为狂犬病的病原体。目前为止,遗传谱系 I 的狂犬病病毒是引起人狂犬病的最常见的病毒型别,也是至今应用于狂犬病疫苗生产的唯一病毒种类。故现有疫苗可能无法为遗传谱系 I 外的其他血清型病毒感染提供保护。
因此,用于疫苗的病毒种类必须慎重选择。生产用毒种应是在实验室细胞培养适应和减毒,并具有稳定生物学特性的固定毒株,其历史和来源应确证清楚,并经过全面的特征性检定,符合国家相关文件的要求。病毒灭活后制成的疫苗对人体安全且能产生有效的免疫保护作用。
WHO 推荐用于疫苗生产的病毒固定毒株包括 Pasteur Virus、Pitman-Moore、Vnukovo-32、Flury 鸡胚细胞低传代株(Low egg passage LEP)和 CTN 株等。
人用狂犬病疫苗应符合 WHO 生物制品标准专家委员会(Expert Committee on Biological Standardization, ECBS)制定的指导原则中对疫苗特性、生产及质量控制的要求。用于制备疫苗的细胞基质应来源于健康动物,动物来源品系清楚。
根据现行《中国药典》的要求,动物必须是清洁级或以上的动物。所用动物应符合实验动物微生物学和寄生虫学检测要求的相关规定。人二倍体及传代细胞应在限定代次内使用。病毒在细胞(或胚蛋)中增殖后,将收获的病毒进行浓缩、纯化、灭活,加入保护剂冻干而成。
细胞培养疫苗的最低效价为在效期内每一剂肌注剂量达 2.5IU 以上,由 NIH 法检测确定。ELISA 法检测糖蛋白等其他体外测定方法目前仍处于实验室验证阶段,但该方法已用于生产过程中抗原含量的控制。
疫苗需经临床前研究及临床试验,企业需获得国家食品药品监督管理总局批准的生产许可证方可生产疫苗。WHO 建议对新申请注册的疫苗,在临床试验中检测 0、14、28/30、180、360 天血清中和抗体水平。已经获准生产的人用狂犬病疫苗需按照国家食品药品监督管理总局的要求申请批签发,仅有获得批签发合格证的狂犬病疫苗批次方可上市使用。
5. 疫苗的血清学效果评价
WHO 仅推荐小鼠脑内中和试验和荧光灶抑制试验(RFFIT)检测中和抗体,两种方法均可以正确评价疫苗免疫后的中和抗体水平,WHO 认为免疫后血清中的病毒中和抗体 ≥ 0.5IU/ml 即达到有效保护水平。
国内外疫苗的临床研究数据显示,疫苗按暴露后的「5 针法」或「2-1-1」等免疫程序接种,大多可在接种后 7 天出现中和抗体,14 天 100% 抗体阳转。而美国 ACIP 认为,疫苗暴露后免疫的 14~28 天中和抗体滴度已处于峰值,28 天的第五针注射不能使抗体继续升高,因此,推荐美国健康成年人的暴露后免疫采用 0、3、7 和 14 天的 4 针免疫程序。
(1)暴露前免疫
Morris 的研究显示,接受 3 针狂犬病疫苗,所有接种者的血清抗体均阳转,但抗体滴度与年龄增长呈负相关。我国使用国产纯化人 Vero 细胞疫苗按照 0、7、21 天各 1 针的程序进行暴露前免疫,结果显示,受试者血清中和抗体阳转率为 100%,几何平均滴度(Geometric mean titer, GMT)为 15.87IU/ml。Sehgal 的研究显示,采用 0、7、21 天程序的暴露前免疫血清中和抗体 GMT 为 7.08 IU/ml 。
使用人二倍体细胞疫苗和 Vero 细胞疫苗分别采用 2 针(0、28 天)和 3 针(0、7、28 天)程序进行暴露前初次免疫,结果显示,初次免疫 2 针组 1 年后抗体明显下降,但 3 针组抗体阳性率仍能维持在 87.9%_100%,加强免疫 1 针后 14 天抗体水平迅速提高。
暴露前程序经加强免疫后抗体可维持较高水平,免疫后 3 年时仍为 12.6IU/ml,5 年时为 10.6IU/ml,第 10 年至少可维持 96% 阳性。此外,在满 10 年时再次加强免疫 1 针,观察全部对象的抗体滴度几乎又恢复到满 1 年加强 1 针后 14 天的水平。
(2)暴露后程序
a.「5 针法」程序的保护性研究 2009 年,Rupprecht CE 对 1976 年至 2008 年间发表的 12 篇狂犬病疫苗研究进行 meta 分析。全部研究共包含 1000 名受试者,所有受试者在第 1 针疫苗免疫后 14 天均产生中和抗体,使用细胞培养疫苗进行免疫接种后产生的抗体滴度一般高于 10IU/ml。
王凌云等发现,对 2~67 岁健康人群按「5 针法」免疫程序分别接种国产和进口冻干 Vero 细胞疫苗,接种后 7 天、14 天两种疫苗血清抗体水平无显著性差异,且首剂接种后 45 天的抗体阳转率均达 100%,14、45 天血清中和抗体 GMT 均大于 0.5IU/ml,两种疫苗间无统计学差异。
叶茂华等发现,经实验室确诊为狂犬病的犬只咬伤的 7 例暴露者使用 5 针法免疫后,全部获得保护。Zhang Xiaowei 一项使用「5 针法」免疫的持续 5 年的疫苗持久性研究显示,接种后产生的中和抗体具有良好持久性及免疫记忆效应。
.「2-1-1" 程序的保护性研究
Zagreb 研究中心的研究结果显示,分别采用人二倍体细胞疫苗、原代牛肾细胞疫苗、纯化鸡胚细胞疫苗、Vero 细胞疫苗按「2-1-1」程序免疫,第 7 天抗体阳转率分别为 65%、38%、83% 和 78%,14 天时全部阳转,抗体水平达到高峰,GMT 为 17.0-54.9IU/ml,继续观察至 28 天抗体水平基本保持不变。
与 0、7、21 天各接种 1 针相比,抗体水平较高。多项血清学研究显示,与 5 针程序相比,「2-1-1」程序第 7 天抗体阳转率和血清抗体水平均更高,14 天和 42 天抗体水平无差异。
对于被狂犬咬伤的实际保护效果,Wasi 在泰国进行的一项原代鸡胚细胞纯化疫苗临床观察中,82 名确认为被狂犬病动物致伤的暴露者分别采用「6 针法」(0、3、7、14、28、90 天各接种一针)和「2-1-1」程序进行免疫接种,根据暴露的严重程度,部分暴露者同时注射狂犬病人免疫球蛋白。
两种方法显示出相似的免疫应答,均能快速提供足够的抗体保护。所有暴露者接种后 1 年 100% 存活,中和抗体 GMT 仍高于 0.5IU/ ml 的保护性水平。使用 Vero 细胞疫苗对 100 名被狂犬严重咬伤的患者进行「2-1-1」程序免疫,同时注射被动免疫制剂,一年后所有人均存活。
国内对于经实验室确认为狂犬病犬只咬伤的暴露者进行 Vero 细胞疫苗「2-1-1」程序接种并联合应用被动免疫制剂,所有受种者抗体全部阳转,6 月后均存活。
目前对「2-1-1」程序的持久性研究数据有限,Vodopija 在 1997 年开展的研究中,分别采用人二倍体细胞、鸡胚细胞和 Vero 细胞纯化狂犬病疫苗进行免疫,第 1100 天测血清抗体 GMT 为 0.61~0.97IU/ml,给予 1 剂加强后 14 天检测血清抗体水平,GMT 增高至 14.28~28.81IU/ml 。
(3)特殊人群
Vodopija R 的研究表明,使用原代鸡胚细胞纯化疫苗的「5 针法」免疫程序接种无临床症状的人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染者,首剂接种后 14 天抗体阳转率为 64%,30 天为 89%。
有明显临床症状的艾滋病(Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS)病人,且 CD4+(cluster of differentiation 4)细胞数低于 300/rriri3 者,对狂犬病疫苗免疫应答很差,首剂接种后 14 天抗体阳转率仅为 25%,30 天仅为 42%。
对于使用免疫抑制药物的患者,狂犬病疫苗接种后应监测患者是否具有适当的病毒中和抗体应答。妊娠妇女几乎均能对狂犬病疫苗产生正常的免疫应答,且对胎儿不会造成不良影响。对接受器官移植的儿童进行肌内接种免疫反应良好。
(4)疫苗效力及免疫失败
icholson 估计在发达国家中应用细胞培养疫苗免疫失败率为每 8 万人中 1 例,而发展中国家为每 1 万 2000 到 3 万人中发生 1 例。
早期最著名的狂犬病疫苗的保护性研究案例之一,是伊朗对 45 例被狂犬病动物致伤的患者接种 6 针次疫苗并联合注射抗狂犬病血清,所有接受暴露预防处置者均存活。
出于伦理的考虑,对狂犬病疫苗有效性的研究不可能设置安慰剂对照,而仅可通过以往经验和案例记载估算,如不经疫苗免疫,预计有 35% 的严重致伤者将患狂犬病死亡。后续在德国、美国以及泰国的狂犬严重暴露后免疫研究均得到类似的结果。
绝大多数狂犬病的发病是由于没有接受规范的暴露后预防处置,包括接受暴露后处置较晚,多处咬伤等严重暴露,以及头、颈部咬伤时难以彻底进行伤口清洗等。Krebs 对于 28 例使用疫苗后仍发病的案例进行回顾性分析发现,90% 的病例未应用被动免疫制剂,或者应用方法不当。
其他操作失误包括应用疫苗 24 小时前进行了被动免疫、局部伤口清洗不当、多部位咬伤未发现细小伤口而遗漏处理、疫苗注射部位不正确(如注射臀部而非三角肌)。只有两例为严重面部咬伤的患者,虽进行了被认为正确的暴露后处置仍然发病。
一项使用原代鸡胚细胞纯化疫苗的有效性随访研究共报道 46 例可疑失败病例,43 例发生在印度,3 例发生在泰国,分析显示所有案例均未完全执行 WHO 的暴露预防处置指南。
2007 年 Wilde 等研究综合报道了 7 例失败病例,均经过正确规范的伤口处理和暴露预防处置,并接受人二倍体细胞疫苗或 Vero 细胞疫苗及抗血清或人免疫球蛋白注射。
免疫失败的原因可能包括:
a.  存在不易察觉的微小穿透性损伤,致使伤口未得到冲洗、消毒,局部未注射免疫球蛋白;
. 病人伴有未被发现的免疫功能减低性疾病或应用免疫抑制性药物而未报告。
王世清的研究显示,暴露后处置失败率为 1.24/ 万,主要原因为狂犬病被动免疫制剂应用率低,未完成全程接种等。
(5)疫苗安全性
WHO 的立场文件中指出,不同种类狂犬病疫苗的安全性和耐受性整体较好。不良反应的出现与狂犬病疫苗的纯度、制备工艺、处方成分及剂型有关,并可能与产品各批次间的差异相关。
此外,疫苗的使用方式(如肌肉注射或皮内注射)和受种者的个体差异也有影响。据统计,约有 35%~45% 的受种者接种部位会出现一过性轻微红疹、疼痛和 / 或红肿,在接种加强针次时尤为显著。5%~15% 的受种者曾观察到一过性发热、头痛、头晕、胃肠道症状等轻微全身不良反应,过敏、神经系统症状等严重不良反应罕见。
1997~2005 年,据美国疫苗不良事件报告系统(Vaccine Adverse Event Reporting System,VAERS)显示,在鸡胚细胞疫苗的所有不良反应中严重不良反应占 7%,主要为神经系统反应和过敏反应,神经系统反应临床表现不一,过敏反应主要表现为荨麻疹、皮疹和血管性水肿。
对人二倍体细胞疫苗安全性和免疫原性的观察中,超过 1770 名志愿者中观察到的不良反应如下:严重上臂疼痛(15%~25%);头痛(5%~8%);不适、恶心,或两者兼有(2%~5%);过敏性水肿(0.1%),过敏反应主要发生于加强免疫之后。加强免疫后,全身过敏反应发生率上升至 6%。
细胞培养疫苗的神经系统并发症少。在注射人二倍体细胞疫苗的数百万个体中,共报告发生 5 例中枢神经系统疾病,包括 GBS 及急性播散性脊髓炎,不超过疾病的基础发生率,可能与接种疫苗无关。目前大规模使用的 Vero 细胞疫苗及原代鸡胚细胞纯化疫苗的神经系统并发症与人二倍体细胞疫苗相仿。
国内对国产与进口 Vero 细胞疫苗安全性对比研究发现,国产疫苗的局部红肿、硬结、疼痛、瘙痒的发生率分别为 1.4%、0.8%、17.1% 和 2.4%;发热、皮疹、头痛、疲劳乏力和其他全身反应的发生率分别为 1.2%、0.4%、2.4%、4.2% 和 0.3%,上述不良反应均在第 7 天完全消失,与进口疫苗的安全性基本一致。
对于肌内接种和皮内接种的不良反应发生率比较,有部分研究显示二者并无显著性差异,但也有研究显示皮内接种的不良反应发生率高于肌内接种,主要表现为局部红斑、疼痛和肿胀,但总体来讲反应较轻微。目前的研究表明,「2-1-1」程序与「5 针法」程序比较,不良反应发生率无显著性差异。
研究表明,孕妇接种狂犬病疫苗是安全的,并且不会对胎儿造成影响。对 202 名孕妇接种 Vero 细胞狂犬病疫苗的观察发现,孕妇的不良反应发生率与非孕妇无显著性差异,国内大量研究的结论与上述观点一致。
(6)暴露前及暴露后预防成本效益评价
国外对于暴露后预防成本效益的相关评价,由于研究地区的自然、社会和经济条件不同,得到的结论也不尽相同。Pannipa 关于泰国儿童暴露前预防与暴露后预防的成本比较发现,当犬咬伤率达到 2%~30% 时,对于儿童采取暴露前免疫和暴露后免疫的预防成本一致,具体取决于应用何种暴露后程序。
美国的研究表明,当感染狂犬病的可能性大于 0.7% 时候,暴露后免疫是经济的。对于低风险区,避免 1 例发病的成本在 50 万到 100 万美金之间,具体数额取决于风险程度。Shim 在坦桑尼亚的研究显示,每伤残调整生命年(Disability Adjusted Life Year,DALY)医疗花费为 27 美元,政府花费为 32 美元。成本效益较低,但对于 1% 的真正暴露于狂犬病的人群来说,非常符合成本效益原则。
国内学者周世红通过建立暴露前及暴露后预防方案的狂犬病发病(死亡)及成本的决策树模型,进行成本效果分析和敏感性分析。在每 10 万人中,暴露前预防可避免 12 人发病,暴露后预防可避免 8 人发病,暴露前预防避免 1 例发病的成本为 273.34 万元,暴露后预防避免 1 例发病的成本为 19.60 万元,前者为后者的 14 倍。
王传林等对暴露后 5 针程序和「2-1-1」程序进行经济成本分析,测算直接医疗成本、直接非医疗成本和间接成本,两种程序的就医成本分别为 694 元、482.2 元,每名患者节省超过 210 元,按每年暴露后接种疫苗 1400 万人计算,采用「2-1-1」程序,全国的就医总成本将节约 29.63 亿元。
被动免疫制剂
WHO 狂犬病专家咨询委员会建议,对于狂犬病病毒 III 级暴露者,应在接种疫苗的同时对伤口进行彻底清洗并在周围浸润注射被动免疫制剂,即人狂犬病免疫球蛋白或马源抗狂犬病血清,以阻止病毒进入神经组织从而获得快速保护作用。另外,对于免疫功能严重低下的暴露者,即使 II 级暴露,也应联合应用被动免疫制剂。
1. 被动免疫制剂的种类
目前国际上狂犬病被动免疫制剂可分为马源免疫球蛋白(Equine rabies immune globulin,ERIG)、马源纯化 F(ab')2 片段制品和人源免疫球蛋白(human rabies immune globulin,HRIG)三种,前两种在国内习惯上沿用「马抗狂犬病血清」的名称(Equine rabies antiserum,ERA)。
我国被批准上市的为马源纯化 F(ab')2 片段制品和 HRIG。依据现行《中国药典 》标准,HRIG 产品效价标准为不低于 100IU/ml,而 ERIG 产品效价标准为不低于 200IU/mL。
HRIG 是采集经人用狂犬病疫苗免疫的人的血浆,采用低温乙醇蛋白分离或其他经批准的分离制造工艺获得的抗狂犬病免疫球蛋白(IgG)。
马源纯化 F(ab')2 片段制品为采用不含人源成分的狂犬病病毒抗原免疫马匹后采集血浆,采用硫酸铵盐析方法获得 ERIG,在 ERIG 基础上经胃蛋白酶水解切除 Fc 段保留完整的 F(ab')2 并高度纯化所得。
ERIG 因其来源相对方便和经济,国内早期暴露后的被动免疫制剂以此产品为主。目前的马源制品均为胃蛋白酶水解制备的 F(ab')2 片段,并改进了纯化方法,以尽量提高制剂的比活性。国内外马抗狂犬病血清的总蛋白含量标准均为 ≤ 17 g/100 ml,国内产品的纯度往往在 10 g/100 ml 左右,其中 F(ab』)2 片段含量不低于 60%,完整 IgG 的含量不高于 10%。
国内 ERA 制品的总蛋白含量绝对值仍须进一步降低,以减少或减轻人体使用后可能引起的异源蛋白所致的不良反应(如血清病,过敏性休克等);其另一个缺点是由于在人体内半衰期较短,因此所需注射剂量比 HRIG 高,增加了不良反应的风险。与此相对,HRIG 由于无异源蛋白反应风险,故不良反应率较低,但其缺点是需要不断从加强免疫的健康人群中获得,来源相对困难,价格昂贵。两者的优缺点比较见表 2 所示。

目前国内生产狂犬病被动免疫制剂的企业及其产品规格详见附表 2。随着狂犬病人免疫球蛋白的供给量增加,患者经济负担将随之减少。
2. 被动免疫制剂的作用机制
抗狂犬病血清作为狂犬病病毒的特异性被动免疫制剂,无需机体免疫应答过程就能够对狂犬病病毒进行即时中和。其主要作用为在疫苗诱导机体产生有效抗体之前,在患者暴露部位立即提供所需的中和抗体,其作用迅速但短暂。而疫苗诱导产生抗体虽需 1~2 周的时间,但抗体可持续存在数年。
从图 3 可以看出狂犬病疫苗暴露后免疫程序启动后分别在 0、3、7、14、28 天诱导产生的抗体滴度变化趋势(实折线),在第一针疫苗注射后至机体产生足量抗体(>0.5IU/mL)之前(主动免疫诱导的保护力空白区或称高风险感染期),被动免疫制剂可为该高风险时段提供免疫保护。
在高风险感染期伤口周围浸润注射的被动免疫制剂可使伤口局部获得高浓度的中和抗体,阻断病毒在伤口中的扩散。值得注意的是,伤口周围浸润注射的中和抗体并不会令外周循环中的抗体水平明显增高,外周循环中的中和抗体水平增高主要依赖于疫苗注射后产生的主动免疫保护。
因此,该阶段被动免疫制剂的浸润注射对疫苗所提供的主动免疫保护所产生的干扰并不严重,但首剂疫苗注射 7 天后,机体已产生较高水平的中和抗体,此时再注射被动免疫制剂已无意义。
3. 被动免疫制剂的保护效果
根据 WHO 狂犬病专家咨询委员会建议,原卫生部颁布的《狂犬病暴露预防处置工作规范(2009 年版)》以及狂犬病疫苗使用说明书等相应规定,III 级暴露即一处或多处皮肤出血性咬伤或被抓伤出血,或被不能确定健康状况的动物唾液污染粘膜,应按暴露后程序在彻底清洗伤口的基础上立即接种疫苗并注射 ERA 或 HRIG。
ERA 按 40IU/kg 给予,HRIG 按 20IU/kg 给予,将被动制剂尽可能多的在咬伤局部浸润注射,剩余部分肌肉注射。对于艾滋病病人等免疫力低下人群,WHO 专家建议即使是 II 级暴露也应联合使用被动免疫制剂。
被动免疫制剂的正确使用十分重要,基本原则是首先在受伤部位局部进行浸润注射,可直接中和刚进入体内的病毒,构建阻遏病毒从伤口向周边神经组织蔓延的第一道屏障。国内很多暴露后免疫失败病例,是因未联合使用被动免疫制剂或使用方法不当造成的。
Khawplod 的研究指出,已单独使用疫苗,而未能及时使用被动免疫制剂的 III 级暴露者,在 7 天内仍应考虑给予被动免疫制剂,其主要依据为在此期间内机体对疫苗的主动免疫保护尚未产生,而局部伤口的浸润注射对于使用疫苗后机体主动免疫产生的影响较小。
抗狂犬病被动免疫制剂的应用最早可追溯到 1891 年,当时即有报道采用疫苗免疫的人全血治疗被疯狼严重咬伤者。此后采用抗血清治疗暴露后病例的案例时有报道,但疗效无法肯定。
WHO 狂犬病专家咨询委员会通过现场观察肯定了疫苗与被动免疫制剂的联合应用效果。1954 年在伊朗一起疯狼咬伤 18 人的事件中,5 人仅单用疫苗治疗,最终 3 人患狂犬病死亡;而暴露程度相似的另外 13 人采用疫苗联合抗血清治疗,最终仅 1 人患病死亡。
伊朗一项为期 17 年的调查显示,单纯用狂犬病疫苗的 298 名重伤病人病死率为 25%,而在疫苗联合抗血清处置的 364 名重伤病人病死率仅为 5.3%。对感染狂犬病病毒的动物模型的研究也发现,尽管均接种狂犬病疫苗,但是否联用抗狂犬病被动免疫制剂的保护效果存在显著性差异。
我国已有多起关于疫苗与被动免疫制剂联合应用效果自然对照的报告。1981 年和 1982 年先后报告两起狂犬病动物伤多人事件,暴露者共 58 人,重伤者中单纯应用疫苗的 3 人均发病死亡,而及时采用疫苗联合马抗狂犬病血清治疗的 26 人均存活。
2004 年,江西省景德镇一狂犬咬伤 29 人,其中 III 级暴露 12 人,1 人未接种疫苗和抗血清发病死亡,而另外 11 人采用疫苗和被动免疫制剂联合处置后全部存活。2010 年报告的一起狂犬咬伤多人面部事件中,单纯采用疫苗治疗的暴露者发病死亡,而其余暴露者采用联合被动免疫制剂治疗后均存活。
由此可见,在疫苗初次免疫接种后的有效中和抗体产生前的窗口期,采用被动免疫制剂联合治疗至关重要,III 级暴露者尤甚。
4. 被动免疫制剂的安全性
最早上市的抗狂犬病被动免疫制剂为马抗狂犬病血清,因血清病发生率高达 40%,美国于 1965 年停止了该抗血清的使用。目前应用的马抗狂犬病血清为利用胃蛋白酶切除 ERIG 免疫球蛋白 Fc 段,通过纯化提高制剂中 F(ab')2 纯度并降低其他血清蛋白成分及过敏物质含量的纯化制剂。
部分马抗狂犬病血清制剂有引起血清病的风险,取决于其总蛋白质含量。一项对使用者的研究发现,ERIG 制剂血清病的发生率从 0.82% 至 6.19% 不等。与 ERIG 相比,纯化的 F(ab')2 制剂血清病发生率大幅降低,且大部分为轻症病例。尽管 F(ab' )2 制剂安全性较好,但由于无法完全除去异性蛋白,仍然不能排除引起个别敏感者出现不良反应的风险。
与马抗狂犬病血清相比,狂犬病人免疫球蛋白(HRIG)则不存在因异源蛋白等因素而导致过敏的风险,不良反应发生率相对更低。其存在的另一个问题就是因其来源于人,理论上具有传播血源性病原体的潜在风险。因此在 HRIG 制品的生产工艺中除采用低温乙醇法外还增加了严格的病毒灭活 / 去除工艺。国内大量的实验和资料证实,目前国内外上市的 HRIG 具有很高的安全性。
5. 经济成本与研究进展
对 HRIG 的经济学研究很少。由于诱导免疫的疫苗成本、人体免疫应答的时间成本以及免疫供血员的人力成本等因素,HRIG 的生产成本非常高。加之 HRIG 要求血清抗体滴度不低于 10IU/mL,对其产量造成限制,故 HRIG 的价格较为昂贵。
马抗狂犬病血清生产成本相对低廉,价格一般为 HRIG 的十分之一,对于发展中国家,ERIG 不失为一种安全、有效的产品。但基于综合因素考虑,美国免疫实施咨询委员会(ACIP)仍优先推荐 HRIG。
鉴于上述被动免疫制剂供应量有限,价格偏高,且存在血清病类过敏反应和血源传播疾病的潜在风险,目前,狂犬病治疗性单克隆抗体研究已取得较大进展。如 2005 年 Bakker 小组获得高亲和活性的人源化单抗 -McABCR57。Lina Sun 等也已成功研发多株具有中和活性的人源化狂犬病治疗性单抗。
依据 WHO 建议,抗狂犬病单克隆抗体制剂应将针对病毒不同抗原位点的多株单抗组合成「鸡尾酒式」组合制剂,以保证单抗制剂对不同病毒株或病毒的不同基因型的有效性。但上述人源化治疗性单克隆抗体离正式商品化尚有一定距离。
狂犬病的预防建议
1. 暴露前预防
(1)基础免疫
所有持续、频繁暴露于狂犬病病毒危险环境下的个体均推荐进行暴露前预防性狂犬病疫苗接种,如接触狂犬病病毒的实验室工作人员、可能涉及狂犬病病人管理的医护人员、狂犬病病人的密切接触者、兽医、动物驯养师以及经常接触动物的农学院学生等。此外,建议到高危地区旅游的游客、居住在狂犬病流行地区的儿童或到狂犬病高发地区旅游的儿童进行暴露前免疫。
免疫程序:第 0 天、第 7 天和第 21 天(或第 28 天)分别接种 1 剂,共接种 3 剂。
接种途径、部位和剂量:肌内注射。2 岁及以上儿童和成人于上臂三角肌注射;2 岁以下儿童于大腿前外侧肌注射。禁止在臀部肌肉注射。每剂 0.5 ml 或 1.0 ml(具体参照产品规格或产品说明书)。
(2)加强免疫
如出于暴露前预防的目的,则已接受全程基础免疫者无需定期进行加强免疫。定期加强免疫仅推荐用于因职业原因存在持续、频繁或较高的狂犬病病毒暴露风险者(如接触狂犬病病毒的实验室工作人员和兽医)。
免疫程序:接触狂犬病病毒的实验室人员每 6 个月监测一次血清中和抗体水平;兽医、动物疫控部门等每 2 年监测一次血清中和抗体水平。当血清中和抗体水平 <0.5 IU/ml 时需加强接种 1 剂。
接种途径、部位和剂量:肌内注射。2 岁及以上儿童和成人于上臂三角肌注射;2 岁以下儿童可在大腿前外侧肌注射。每剂 0.5 ml 或 1.0 ml(具体参照产品规格或产品说明书)。
(3)使用禁忌
对于暴露前预防,对疫苗中任何成分曾有严重过敏史者应视为接种同种疫苗的禁忌症。妊娠、患急性发热性疾病、急性疾病、慢性疾病的活动期、使用类固醇和免疫抑制剂者可酌情推迟暴露前免疫。免疫缺陷者不建议进行暴露前免疫,如处在狂犬病高暴露风险中,亦可进行暴露前免疫,但完成免疫接种程序后需进行中和抗体检测。对一种品牌疫苗过敏者,可更换另一种品牌疫苗继续原有免疫程序。
2. 暴露后预防
(1)暴露的定义与分级
狂犬病暴露是指被狂犬、疑似狂犬或者不能确定是否患有狂犬病的宿主动物咬伤、抓伤、舔舐粘膜或者破损皮肤处,或者开放性伤口、粘膜直接接触可能含有狂犬病病毒的唾液或者组织。此外,罕见情况下,可以通过器官移植或吸入气溶胶而感染狂犬病病毒。
按照暴露性质和严重程度将狂犬病暴露分为三级:
I 级暴露:符合以下情况之一者:
a. 接触或喂养动物;
.  完好的皮肤被舔;
c. 完好的皮肤接触狂犬病动物或人狂犬病病例的分泌物或排泄物。
II 级暴露:符合以下情况之一者:
a. 裸露的皮肤被轻咬;
. 无出血的轻微抓伤或擦伤。
首先用肉眼仔细观察暴露处皮肤有无破损;当肉眼难以判断时,可用酒精擦拭暴露处,如有疼痛感,则表明皮肤存在破损(此法仅适于致伤当时测试使用)。
III 级暴露:符合以下情况之一者:
a. 单处或多处贯穿皮肤的咬伤或抓伤(「贯穿」表示至少已伤及真皮层和血管,临床表现为肉眼可见出血或皮下组织);
. 破损皮肤被舔舐(应注意皮肤皲裂、抓挠等各种原因 查看全部

近期,由中国疾病预防控制中心办公室指定的《狂犬病预防控制技术指南(2016)》一文,发布在中国疾病预防控制中心官网,现整理如下,供广大医生参考学习。
摘要
狂犬病是由狂犬病病毒感染引起的一种动物源性传染临床大多表现为特异性恐风、恐水、咽肌痉挛、进行性瘫痪等。近年来,狂犬病报告死亡数一直位居我国法定报告传染病前列,给人民群众生命健康带来严重威胁。
为指导基层疾控机构做好狂犬病的预防控制工作,尤其是暴露后的预防处置,降低狂犬病所致死亡,中国疾病预防控制中心组织专家,参考世界卫生组织和美国疾控中心的技术指南,以及国内外最新研究进展,制定了《狂犬病预防控制技术指南(201 6 版)》。
本指南系统回顾了狂犬病的病原学、临床学、实验室诊断、流行病学、疫苗和被动免疫制剂的种类、机理、效果、安全性和不良反应监测与处置,以及暴露预防处置方法等内容的科学证据,在此基础上对狂犬病暴露前和暴露后预防处置的伤口处置、疫苗接种和被动免疫制剂使用等技术给出了推荐建议。
本指南适用于从事狂犬病防控工作的各级各类疾病预防控制机构、狂犬病暴露预防处置门诊、医疗机构感染科和急诊科等专业人员。根据狂犬病的国内外研究进展,本指南今后将不断更新、完善。
病原学和实验室诊断
1. 病原学
狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)属于单负病毒目(Mononegavirales)弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒属(Lyssavirus)。狂犬病病毒颗粒呈子弹状,长 100~300nm,直径约 75nm。病毒基因组长约 12kb,为不分节段的单股负链 RNA,从 3'到 5' 端依次编码 5 种结构蛋白,分别为核蛋白(Nucleoprotein,N)、磷蛋白(Phosphoprotein,P)、基质蛋白(Matrixprotein,M)、糖蛋白(Glycoprotein,G)和依赖 RNA 的 RNA 多聚酶(RNA dependent RNA polymerase or Large protein,L)。
病毒颗粒由囊膜(Envelope)和核衣壳(Nucleocapsid)两部分组成,基因组 RNA 及外层紧密盘绕的 N、P、L 蛋白共同构成具有转录、翻译功能的核衣壳;颗粒外层脂质膜表面镶嵌着 G 蛋白以三聚体构成的纤突 ( Spike),为病毒中和抗原及与宿主受体结合的部位,M 蛋白位于外壳内侧和核衣壳之间,连接内外两部分。
狂犬病病毒不耐高温,悬液中的病毒经 56 度 30~60 分钟或 100 度 2 分钟即失去感染力。脑组织内的狂犬病病毒在常温、自溶条件下,可保持活力 7~10 天,4 度 可保存 2~3 周。狂犬病病毒在 pH 7.2~8.0 较为稳定,超过 pH 8 易被灭活。狂犬病病毒对脂溶剂(肥皂水、氯仿、丙酮等)、乙醇、过氧化氢、高锰酸钾、碘制剂以及季铵类化合物(如苯扎溴铵)等敏感。1:500 稀释的季胺类消毒剂、45%~70% 乙醇、1% 肥皂水以及 5%~7% 碘溶液均可在 1 分钟内灭活病毒,但不易被来苏水溶液灭活。
不同型别狂犬病病毒的致病性不同:在犬、猫等哺乳动物中传播,也称「街毒」的狂犬病病毒毒力很强,感染后一旦出现临床症状,病死率几乎 100%,是世界上病死率最高的传染病;而在蝙蝠中传播的狂犬病病毒毒力相对较弱。
直到 20 世纪 50 年代,RABV 一直被认为是狂犬病的唯一病原。通过对来自尼日利亚的与 RABV 有血清学相关性的病毒即 LBV(Lagos bat virus)和 MOKV(Mokola virus)的鉴定,以及对(1970 年分离自南非被蝙蝠咬伤病人的 DUVV(Duvenhage virus)病毒的分析,发现了狂犬病病毒群的复杂性,由此出现了「狂犬病相关病毒(Rabies-related virus)」和「狂犬病血清型」的术语,目前分别将 RABV、LBV、MOKV、DUVV 确定为四种血清型。
1950 年以来在欧洲分离到的蝙蝠病毒与 DUVV 呈血清学相关性,应用单克隆抗体反应将欧洲蝙蝠病毒进一步分为 EBLV-1(European bat lyssavirus 1)和 EBLV-2(European bat lyssavirus 2)。
针对狂犬病相关病毒多样性的遗传进化研究,产生了新的专业术语「基因型」,并继续发现了新的基因型,如 1997 年从澳大利亚果蝠中分离到的 ABLV(Australian bat lyssavirus)确定为基因 7 型。
为了更好地对日益增多的狂犬病相关病毒进行归类,国际病毒分类委员会(International Committee of Taxonomy Virus,ICTV)主持设立了狂犬病病毒属,将现存的基因型作为狂犬病病毒分类的基础,并结合系统发生进化树的拓扑结构、单克隆抗体反应谱,以及生态、宿主、地理范围等特征确立了病毒种类。
2014 年,ICTV 最新分类结果明确了 14 种(Species)狂犬病病毒。
除了上述 7 个基因型代表 7 种不同的狂犬病病毒外,21 世纪新发现的另外 7 种病毒包括从中亚食虫蝙蝠中分离到的 KHUV(Khujand virus)和 ARAV(Aravan virus),从俄罗斯食虫蝙蝠中分离到的 IRKV(Irkut virus)和 WCBV(West Caucasian bat virus),从非洲肯尼亚食虫蝙蝠中分离到的 SHIBV(Shimoni bat virus),从法国、德国食虫蝙蝠中分离到的 BBLV(Bokeloh bat lyssavirus)和坦桑尼亚非洲灵猫身上分离到的 IKOV(Ikoma lyssavirus) 。
2011 年从西班牙蝙蝠中分离到的 LLEBV(Lleida bat lyssavirus)尚未经 ICTV 明确归类。
2. 实验室诊断
标本采集:病人发病后(死亡前)可采集其唾液(间隔 3~6 小时,至少采集 3 份)、脑脊液、血清及颈后带毛囊的小块皮肤;病人死后最好采集其脑组织标本(小脑和脑干)进行实验室检测。
直接免疫荧光法(Direct Fluorescent Antibody Test,DFA)是狂犬病诊断的金标准,可以快速、敏感、特异地检测人和动物脑组织中的病毒抗原。临床病例活体组织标本(如颈后部皮肤毛囊)亦可进行 DFA 检测。直接快速免疫组化法(Direct Rapid Immunohistochemical Test,DRIT)及酶联免疫吸附测定法(Enzyme-Iinked Immuno Sorbent Assay,ELISA)亦可特异检测狂犬病病毒抗原。
病毒核酸检测可用于早期诊断,以逆转录 PCR 法(Reverse  Transcription-PCR,  RT-PCR)(包括 Real-time RT-PCR)检测体液(唾液、血清等)和脑组织等标本,但需要严格的质量控制以保证结果的准确性。脑组织及唾液等病毒含量高的样本还可进行病毒分离。细胞培养分离所需时间(1~2 天)远少于小鼠颅内接种分离法所需时间(10~21 天),且前者的生物安全风险远小于后者。
未接种过疫苗的患者,发病早期几乎没有中和抗体产生,到发病晚期(通常在临床症状出现后 7-8 天),病毒在脑内大量增殖后突破血脑屏障进入血液,刺激机体产生低水平的中和抗体。通过病毒中和试验检测病人血清或脑脊液中的中和抗体,可作为狂犬病诊断的依据之 -。
世界卫生组织(Mrorld Health Organization,WHO)推荐的抗狂犬病病毒中和抗体标准检测方法包括快速荧光灶抑制试验 ( Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test.RFFIT)和小鼠脑内中和试验(Mouse Neutralization Test,MNT)。
由于 RFFIT 法无需使用小鼠,所用时间短(24 小时),目前已被广泛采用。RFFIT 方法也是我国现行药典规定的检测狂犬病病毒中和抗体的标准方法之一。
此外,常用的狂犬病病毒中和抗体检测方法还有荧光抗体病毒中和试验(Fluorescent AntibodyVirus Neutralization Test, FAVNT)。用 ELISA 法测定的抗狂犬病病毒糖蛋白抗体滴度与用病毒中和试验测定的结果有一定的相关性(约 80% 符合率),但相应试剂盒尚未普及。
此外,还可以通过检测中和抗体,监测暴露前抗体背景及暴露后疫苗注射的免疫效果。WHO 狂犬病专家咨询委员会认为:中和抗体水平等于或高于 0.5IU/ml 时,接种者才具备了有效的保护能力;如果发现中和抗体水平低于 0.5IU/ml,应进行加强免疫,至达到有效保护水平为止。
临床学
1. 发病机理
大多数人间狂犬病病例是由于被患狂犬病的动物咬伤所致,少数是由于被抓挠或伤口、粘膜被污染所致,因移植狂犬病患者捐赠的器官或组织发病也偶有报道,但病毒不能侵入没有损伤的皮肤。
嗜神经性是狂犬病病毒自然感染的主要特征,病毒的复制几乎只限于神经元内。病毒最初进入伤口时,不进入血液循环(通常在血液中检测不到狂犬病病毒),而是在被咬伤的肌肉组织中复制,然后通过运动神经元的终板和轴突侵入 外周神经系统。
在一些蝙蝠变异株中,由于嗜皮肤性,病毒增殖也可以发生在感觉神经。病毒进入外周神经后,以运输小泡为载体,沿轴突以逆轴浆运动的方向向中枢神经系统「向心性」移行,而不被感觉或交感神经末梢摄取。其移行速度取决于转运方式,逆向轴突运输速度较快,可达 5~100 mm/ 天,如一定范围内(如 10μm 至 2 cm)的突触同时受感染,病毒移行速度甚至会更快。
病毒在轴突移行期间不发生增殖,当到达背根神经节后,病毒即在其内大量增殖,然后侵入脊髓和整个中枢神经系统。动物实验发现,狂犬病病毒从脊髓上行到脑的扩散速度非常迅速,一旦侵入脑则迅速增殖,脑干最先受累,也是感染最重的区域。
在中枢神经系统中增殖后,病毒通过在运动轴突的顺向轴浆运输「离心性」扩散进入腹侧根、被根神经节及其感觉轴突,并感染感觉轴突支配的肌梭、皮肤、毛囊及其他非神经组织,主要累及神经丛和唾液腺腺泡细胞,并经唾液腺排放到唾液中,再由咬伤伤口或被带毒唾液污染的粘膜传播到下一个受害者。
在感染末期,心、胰腺、肾上腺和胃肠道等神经外组织也同时受累。临床发病时,病毒已广泛分布于中枢神经系统及神经外的器官中。
人间狂犬病潜伏期从 5 天至数年(通常 2~3 个月,极少超过 1 年),潜伏期长短与病毒的毒力、侵入部位的神经分布等因素相关。病毒数量越多、毒力越强、侵入部位神经越丰富、越靠近中枢神经系统,潜伏期就越短。
此外,肌肉特异性小 RNA 可能通过抑制病毒在肌肉中的转录和复制影响潜伏期。狂犬病实验感染动物(如犬)的最长潜伏期为半年。在潜伏期内,病毒主要存在于外周肌肉或神经细胞中。
包括人类在内的多种哺乳动物感染狂犬病病毒后,随着病毒在中枢神经系统的扩散,均可引起严重的进行性脑、脊髓、脊神经根炎,病毒数量与临床症状的严重程度无关。人类的临床表现可分为狂躁型和麻痹型两种,临床分型可能与病毒对神经组织不同位点的特异性反应有关,而与病毒在中枢神经系统内的解剖定位无关。
电生理学研究发现,麻痹型狂犬病的虚弱症状与外周神经轴突病变或者脑白质变性有关。病毒首先侵入运动神经元解释了狂躁型狂犬病人亚临床的前角细胞功能失调要早于感觉消失症状的出现,并且症状首先发生在被咬伤部位附近,再逐渐发展到身体其他部位。同样的解释也适用于麻痹型狂犬病人的前驱症状和体征。
犬类麻痹型狂犬病的核磁弥散张量成像显示,脑干部位神经束的完整性受损,限制了病毒向前脑的传播。病毒的免疫逃避策略加之血脑屏障的完整性阻碍了中枢神经系统中病毒的清除。目前尚无狂犬病病人因免疫抑制或加强而死亡的证据。
如无重症监护,病人会在出现神经系统症状后 1~5 天内死亡。目前对狂犬病导致死亡的病理生理学尚未阐明。尽管脑、脊髓、脊神经根的炎症广泛分布,但并没有破坏神经组织结构。死因可能是由于控制循环和呼吸系统的中枢神经系统受累或功能障碍。
1. 临床表现与诊断标准
(1)狂犬病暴露者的伤口感染对于狂犬病暴露者而言,除了罹患狂犬病的风险外,动物咬伤还可以导致各种复杂的外科伤口、可能的严重并发症以及继发的细菌感染。致伤动物不同,所导致的伤口类型、临床特点以及预后均有所不同。
例如,普通外科创伤的伤口感染率通常为 5%~7%,而在 III 级暴露中,犬咬伤伤口大部分为撕裂伤(约 60%~76.5%),而猫咬伤大部分为穿刺伤(约 85.3%);犬咬伤伤口平均感染率约 14.8%,而猫咬伤约为 26.8%;手、足部位的咬伤伤口感染率明显较其他部位要高;犬咬伤容易引起化脓性软组织感染,而猫咬伤容易引起淋巴管 / 淋巴结炎、丹毒等。
引起咬伤伤口感染的细菌主要来源于动物口腔,48% 的犬咬伤和 63% 的猫咬伤感染伤口分离出需氧和厌氧菌混合感染,犬咬伤感染伤口分离出的主要细菌是犬属巴斯菌属,而出血败血型巴斯菌属是猫咬伤感染伤口内最主要的菌种。灵长类咬伤感染伤口内分离的菌种包括嗜血杆菌、核粒梭形菌、微小消化链球菌、放线菌属、产碱杆菌和直肠沃林氏菌(拟杆菌属)。
猪咬伤伤口分离出的菌种主要包括猪放线菌、拟杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、多杀性巴斯杆菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌(耐甲氧西林 MRSA)等。巴斯菌属、链球菌、葡萄球菌、摩拉克菌和奈瑟菌属是最常见的需氧菌;梭形杆菌属、拟杆菌属、噬卟啉拟杆菌属是最常见的厌氧菌,且其中大部分细菌为产 β- 内酰胺酶,甚至是耐甲氧西林的菌种(MRSA),因此,在伤口感染或预防性使用抗生素时,需考虑病原菌耐药因素。
(2)狂犬病的临床表现
狂犬病在临床上可表现为狂躁型(大约 2/3 的病例)或麻痹型。由犬传播的狂犬病一般表现为狂躁型,而吸血蝙蝠传播的狂犬病一般表现为麻痹型。
狂躁型患者以意识模糊、恐惧痉挛,以及自主神经功能障碍(如瞳孔散大和唾液分泌过多等)为主要特点。麻痹型患者意识清楚,但有与吉兰一巴雷综合征(Guillain-Barre Syndrome,GBS)相似的神经病变症状。GBS 是脊神经和周围神经的脱髓鞘疾病,又称急性特发性多神经炎或对称性多神经根炎,临床主要表现为进行性、上升性、对称性麻痹,四肢软瘫,以及不同程度的感觉障碍。
与 GBS 不同的是,狂犬病患者一般伴有高热、叩诊肌群水肿(通常在胸部、三角肌和大腿)和尿失禁,而不伴有感觉功能受损。
根据病程,狂犬病的临床表现可分为潜伏期、前驱期、急性神经症状期(兴奋期)、麻痹期、昏迷和死亡几个阶段。但实际上发病是一个连续的临床过程,而不是简单的一系列可以独立分割的表现。
a.   潜伏期:从暴露到发病前无任何症状的时期,一般为 1~3 个月,极少数短至两周以内或长至一年以上,此时期内无任何诊断方法。
. 前驱期:患者出现临床症状的早期,通常以不适、厌食、疲劳、头痛和发热等不典型症状开始,50%~80% 的患者会在原暴露部位出现特异性神经性疼痛或感觉异常(如痒、麻及蚁行感等),可能是由于病毒在背根神经节复制或神经节神经炎所致。此时期还可能出现无端的恐惧、焦虑、激动、易怒、神经过敏、失眠或抑郁等症状。前驱期一般为 2~10 天(通常 2~4 天)。
c. 急性神经症状期:患者出现典型的狂犬病临床症状,有两种表现,即狂躁型与麻痹型。
狂躁型患者出现发热并伴随明显的神经系统体征,包括机能亢进、定向力障碍、幻觉、痉挛发作、行为古怪、颈项强直等。其突出表现为极度恐惧、恐水、怕风、发作性咽肌痉挛、呼吸困难、排尿排便困难及多汗流涎等。
恐水、怕风是本病的特殊症状,典型患者见水、闻流水声、饮水或仅提及饮水时,均可引起严重的咽喉肌痉挛。患者虽渴极而不敢饮,即使饮后也无法下咽,常伴声嘶及脱水。亮光、噪声、触动或气流也可能引发痉挛,严重发作时尚可出现全身疼痛性抽搐。由于常有呼吸肌痉挛,故可导致呼吸困难及发绀。
大多数动物狂犬病病例的机能亢进期会持续数小时至数天,人间狂犬病病例的机能亢进为间歇性,由数个持续 1~5 分钟的兴奋期组成。患者的神志大多清楚,亢进期之间,患者一般合作,并可以进行交流。急性神经症状期的其他异常表现包括肌束震颤(尤其是暴露部位附近)、换气过度、唾液分泌过多、局部或全身痉挛,以及一些较罕见的症状,包括阴茎异常勃起或性欲增强,这些体征都与自主神经功能障碍有关。本期一般持续 1~3 天。
麻痹型患者无典型的兴奋期及恐水现象,而以高热、头痛、呕吐、咬伤处疼痛开始,继而出现肢体软弱、腹胀、共济失调、肌肉瘫痪、大小便失禁等,呈现横断性脊髓炎或上升性脊髓麻痹等类 GBS 表现。其病变仅局限于脊髓和延髓,而不累及脑干或更高部位的中枢神经系统。
d. 麻痹期:指的是患者在急性神经症状期过后,逐渐进入安静状态的时期,此时痉挛停止,患者渐趋安静,出现弛缓性瘫痪,尤以肢体软瘫最为多见。麻痹可能是对称性或非对称性的,以被咬肢体侧更为严重;或者呈上升性,类似 GBS。
眼肌、颜面部肌肉及咀嚼肌也可受累,表现为斜视、眼球运动失调、下颌下坠、口不能闭、面部缺少表情等。进而患者的呼吸渐趋微弱或不规则,并可出现潮式呼吸;脉搏细数、血压下降、反射消失、瞳孔散大。临终前患者多进入昏迷状态,呼吸骤停一般在昏迷后不久即发生。本期持续 6~18 小时。
狂犬病的整个自然病程一般不超过 5 日。死因通常为咽肌痉挛而窒息或呼吸循环衰竭。本病在临床上需与破伤风、病毒性脑膜脑炎、脊髓灰质炎、GBS 等相鉴别。
(3)诊断标准
原国家卫生部 2008 年颁布的狂犬病诊断标准:
根据患者的流行病学、临床表现和实验室检查结果进行综合判断,病例确诊需要实验室证据。
a. 临床诊断病例
符合下列任一项即可诊断:典型的狂躁型狂犬病临床表现;明确的动物致伤史 + 典型的麻痹型狂犬病临床表现。    
. 确诊病例
临床诊断病例加下列任一项,即可确诊:直接荧光抗体法(或 ELISA 法):检测患者唾液、脑脊液或颈后带毛囊的皮肤组织标本中狂犬病病毒抗原阳性,或用 RT-PCR 检测狂犬病病毒核酸阳性;细胞培养方法:从患者唾液或脑脊液等标本中分离出狂犬病病毒;脑组织检测:尸检脑组织标本,用直接荧光抗体法或 ELISA 法检测狂犬病病毒抗原阳性、RT-PCR 检测狂犬病病毒核酸阳性、细胞培养方法分离出狂犬病病毒。
c. WHO 的狂犬病定义
临床病例:病例具有急性神经性综合征(如脑炎),主要表现为机能亢奋(如狂躁型狂犬病)或者麻痹综合征(如麻痹型狂犬病),如果没有重症监护支持,病人通常会在首发症状出现后 7-11 天内进行性发展为昏迷和死亡,常见死因为呼吸循环衰竭。
符合下列实验室标准中的 1 种或几种即可确诊:
存在病毒抗原;细胞培养方法或实验动物接种中分离到病毒;未接种疫苗者的脑脊液或血清中存在病毒特异性抗体;通过分子生物学方法在活体或尸检样本(如脑活检样本、皮肤、唾液、浓缩尿)中检测到病毒核酸。
WHO 的狂犬病病例分类如下:
疑似病例:符合临床病例定义的病例;
可能病例:疑似病例,同时具有与疑似狂犬病动物接触的可靠病史;
确诊病例:实验室确认的疑似病例或可能病例。
在缺少动物暴露史或临床疑似脑炎症状的情况下,如果实验室诊断检测明确,仍可进行确定性诊断。对可能感染狂犬病的患者在采取适当预防措施情况下进行核磁共振成像检查可能有助于诊断。
无论临床类型如何,当脑干、海马、下丘脑、深层和皮层下白质以及深层和皮质灰质的核磁共振 T2 成像出现模糊、微弱的异常高信号时,均提示可能为狂犬病。疾病晚期,当患者进入昏迷状态时,增强核磁可以清楚地显示上述改变,这些特征可用来将狂犬病与其它病毒性脑炎相区别。脑部 CT 几乎没有诊断价值。
流行病学
1. 疾病负担
狂犬病在全球广泛分布,除南极洲外,所有大陆均有人间狂犬病报告。进入 21 世纪后,狂犬病仍然是重要的公共卫生威胁,全球每年约有 60000 人死于狂犬病,是致死人数最多的动物源性传染病,每年由此引发的经济负担约为 40 亿美元。
目前,除许多太平洋岛国无狂犬病报告外,仅有澳大利亚消除了肉食动物狂犬病,西欧、加拿大、美国、日本、马来西亚和少数拉丁美洲国家消除了犬狂犬病。
目前,99% 的人间狂犬病发生在发展中国家,主要分布在亚洲、非洲和拉丁美洲及加勒比海地区。亚洲的狂犬病病例数居全球首位,估计年死亡人数达 30000 人(95%CI,8100~61400)。印度为当前狂犬病疫情最严重的国家,据估计年狂犬病发病数为 2 万~3 万例,发病率为 2/10 万。
中国人间狂犬病发病仅次于印度,2007 年疫情高峰时,年报告病例数达 3300 例。2004~2014 年,狂犬病死亡人数一直高居我国传染病死亡数的前 3 位。此外,调查显示,部分地区狂犬病漏报率可能高达 35%,提示我国狂犬病的疾病负担可能存在低估。
2. 感染动物来源
狂犬病在自然界的储存宿主动物包括食肉目动物和翼手目动物,狐、狼、豺、鼬獾、貉、臭鼬、浣熊、猫鼬和蝙蝠等也是狂犬病的自然储存宿主,均可感染狂犬病病毒成为传染源,进而感染猪、牛、羊和马等家畜。狂犬病易感动物主要包括犬科、猫科及翼手目动物,禽类、鱼类、昆虫、蜥蛎、龟和蛇等不感染和传播狂犬病病毒。
全球范围内,99% 的人间狂犬病是由犬引起,特别是亚洲、非洲等狂犬病流行区,犬是引起人间狂犬病的最主要原因。而犬狂犬病疫情控制较好的欧洲、北美、澳大利亚及部分拉丁美洲国家的传染源为蝙蝠、狐、豺、狨猴、猫鼬和浣熊等野生动物。
宿主动物中,蝙蝠较为特殊,由于蝙蝠暴露可能为极难察觉的细微咬伤或损伤,从而导致暴露风险大为提高。WHO 及美国 CDC(Centers for Disease Control)均将蝙蝠暴露归类为严重暴露,要求将其按照 III 级暴露进行处置。
美国和加拿大 1950~2007 年间 56 例蝙蝠导致的人间狂犬病病例中,有明确咬伤史者仅 22 例(39%);与蝙蝠直接接触而无咬伤(如触摸蝙蝠)者 9 例(16%);有 6 例(11%)并无明确接触史,仅发现房间内有蝙蝠;而无直接接触者为 19 例(34%)。
WHO 指出,对北美洲和欧洲狂犬病流行地区的野生和家栖啮齿类动物的大规模检测显示,此类动物极少感染狂犬病,狂犬病病毒终端溢出性感染仅为偶发事件,说明此类动物并非狂犬病的贮存宿主,也不参与该疾病的流行和传播。
美国 CDC 也指出,啮齿类(尤其小型啮齿类,如:花栗鼠、松鼠、小鼠、大鼠、豚鼠、沙鼠、仓鼠)和兔形目(包括家兔和野兔)极少感染狂犬病,也未发现此类动物导致人间狂犬病的证据。根据美国 20 年(1985-2004 年)的监测,尽管在浣熊狂犬病发病地区,偶有旱獭(土拨鼠)感染狂犬病的记录,但从未在小型啮齿动物中检测到狂犬病病毒,也无啮齿类或兔形目动物导致人间狂犬病病例的证据。
3. 我国狂犬病流行特征
20 世纪 50 年代以来,我国狂犬病先后出现了 3 次流行高峰。第一次高峰出现在 20 世纪 50 年代中期,年报告死亡数曾逾 1900 人。第二次高峰出现在 20 世纪 80 年代初期,1981 年全国狂犬病报告死亡 7037 人,为新中国成立以来报告死亡数最高的年份。
整个 80 年代,全国狂犬病疫情在高位波动,年报告死亡数均在 4000 人以上,年均报告死亡数达 5537 人。第三次高峰出现在 21 世纪初期,狂犬病疫情在连续 8 年快速下降后,重新出现快速增长趋势,至 2007 年达到高峰,当年全国报告死亡数达 3300 人。
在第三次疫情高峰前后,我国采取了一系列遏制狂犬病的措施,包括落实狂犬病防控措施、建立狂犬病多部门防控机制、强化犬只管理和动物狂犬病防治,以及加强人用狂犬病疫苗和被动免疫制剂质量监管等,取得了较为显著的防治效果。自 2008 年起,我国狂犬病疫情出现持续回落,至 2014 年报告发病数已降至 1000 例以下,较 2007 年的峰值下降了 72%。
历史上我国所有省份均报告过狂犬病病例。近年狂犬病疫情主要分布在人口稠密的华南、西南、华东地区,但其他省份也时有疫情报告。1996~2008 年,除西藏和青海外,其余 29 省均有狂犬病病例报告,报告病例数排名前 10 位的省份为广西、湖南、贵州、广东、江西、江苏、湖北、河南、四川和安徽,报告病例占全国总数的 86.9%。   
2007 年以来,狂犬病波及地区数呈下降趋势,但速度相对缓慢。2007 年全国 23 省共 993 个县(区)报告病例,2014 年仍有 567 个县(区)报告病例。2007 年后,多数省份狂犬病疫情呈下降趋势,特别是疫情较重的省份下降显著,但疫情有向北和向西北地区扩展的趋势,河北、山西、云南、陕西、海南、重庆等既往报告发病数较少的省份曾一度出现疫情上升。2012 年后,各省疫情均呈持续下降趋势。
我国每个月均有狂犬病病例报告,夏秋季高发,发病高峰一般出现在 8 月。2005~2011 年监测数据分析显示,不同地区的季节性特征存在差异,纬度越高季节性越明显,病例发病的时间相对集中。
病例呈现「三多」的特征:农村地区病例较多,农民一般占病例总数的 65% 以上;男性病例数约为女性的 2 倍;15 岁以下儿童和 50 岁以上人群发病较多,1996~2008 年近 25% 的病例为 15 岁以下儿童。
病例主要由犬伤所致,约占 90% 左右;其次为猫,占 5% 左右,其他致伤动物包括马、松鼠、猪、蝙蝠、猴和獾等,但较为少见,仅占不到 5%。约 50% 伤人动物为家养,其中绝大多数家养动物未接种动物狂犬病疫苗,流浪动物约占伤人动物总数的 25%。
根据我国人用狂犬病疫苗的使用量,估计全国年暴露人口数逾 4000 万。部分狂犬病高发省份的监测显示,90% 以上的暴露就诊人群为 II 级和 III 级暴露,其中 III 级暴露约 40%。全部暴露者中,约 10% 未全程接种疫苗;III 级暴露者中,仅 15% 左右接受被动免疫制剂注射。绝大多数病例由狂犬病病毒街毒感染所致,但也有少量由狂犬病毒属相关病毒感染致病的报道。
人用狂犬病疫苗
1. 人用狂犬病疫苗的历史和现状
1882 年,法国人路易巴斯德先生首次成功发明了人用狂犬病疫苗,之后经历了早期的动物神经组织疫苗、禽胚疫苗、细胞培养的粗制疫苗,发展到目前技术日趋完善的原代地鼠肾细胞、鸡胚细胞、人二倍体细胞和 Vero 细胞培养的纯化疫苗。
早期的神经组织疫苗免疫效果不佳(全程免疫后仍有 1‰  的死亡病例),且疫苗接种后局部和全身反应严重,由于疫苗中含有动物脑组织的髓磷脂成分,接种后可能引起神经性麻痹反应(变态反应性脑脊髓炎)。WHO 于 1984 年建议停止生产和使用神经组织疫苗,目前各国已陆续停止使用。
20 世纪 60 年代起,采用细胞和组织胚胎培养技术生产的狂犬病疫苗(Cell Culture and Embryonated Egg-based Rabies Vaccines,CCEEVs)取得了长足发展。由于采用了细胞培养和纯化技术,CCEEVs 避免了产品中残留动物脑组织、细胞蛋白残留等引起的不良反应,提高了疫苗效价和免疫后抗体水平,减少了注射针次,最大限度降低了免疫失败病例。
现已证明,CCEEVs 可安全有效地预防狂犬病。目前广泛使用的有 Vero 细胞纯化疫苗、人二倍体细胞疫苗、纯化鸡胚细胞疫苗和原代地鼠肾细胞疫苗等。
人二倍体细胞疫苗(Human Diploid Cell Rabies Vaccine,HDCV)为美国 Wistar 研究所首创,随后法国 Merieux 研究所 1974 年获得生产许可,经多中心临床人体观察,该疫苗接种后不良反应发生率低、症状轻,免疫效果好。但是人二倍体细胞增殖慢、病毒产量低、疫苗成本高、价格贵、尚不能得到广泛应用。
纯化 Vero 细胞狂犬病疫苗由法国 Merieux 研究所于 1985 年获得生产许可,人体观察不良反应轻、效果好,与人二倍体细胞疫苗有着同样的安全性和效力。而且由于培养的狂犬病病毒滴度高、疫苗产量大、价格低,在世界范围得到了广泛的应用。
纯化鸡胚细胞疫苗和原代地鼠肾细胞疫苗根据不同厂家的临床观察,其不良反应较轻微,免疫效果、安全性和有效性均较好。
现代生物技术的发展为新型疫苗的研究提供了更多可能性,比如重组疫苗、DNA(Deoxyribonucleic acid)疫苗、多肽疫苗等。但是与纯化细胞疫苗相比,大部分没有优势,个别重组疫苗已应用于野生动物,但目前在人体的研究进展不明。例如,临床实验结果显示,含有狂犬病 G 蛋白的痘苗和金丝雀痘病毒载体疫苗接种 2 剂可产生中和抗体,但抗体水平低于人二倍体细胞疫苗。
2. 我国人用狂犬病疫苗的历史和现状
1980 年以前,我国一直生产和使用羊脑制备的经石炭酸灭活的脑组织疫苗。
1965 年,我国开始研制原代地鼠肾细胞培养的原液灭活疫苗,此疫苗须加入氢氧化铝(AI(OH)3)作为佐剂以增加疫苗效力,1980 年获生产许可证书,当时以 Habel 法测定疫苗效力,要求保护指数 ≥ 1 0000,需皮下注射 14 针;后改用 NIH 法测定效价,效价定为 1.3IU/2 ml,免疫程序也改为 5 针法。
Fangtao Lin 的研究显示,该疫苗注射后抗体水平高于羊脑疫苗,对确诊为狂犬病的动物致伤的暴露者有保护作用。由于新疫苗效价仍较低且免疫失败病例频发,卫生部决定改进疫苗生产工艺,将疫苗培养的病毒原液超滤浓缩 3~5 倍以提高疫苗中抗原含量,使加入氢氧化铝佐剂后的疫苗效价能达到 ≥ 2.5IU 的标准。
然而,单纯浓缩疫苗在提高效力的同时,由于杂质蛋白残留物含量相应增高,不良反应发生率升高且症状加重,严重不良反应发生率达 5%~10%。此后,为改进疫苗的质量特性,引入柱层析等纯化技术去除杂质蛋白,疫苗仍然添加氢氧化铝佐剂,NIH 法检测效价可达 2.5IU 以上,达到了 WHO 设定的疫苗有效标准。
使用 WHO 推荐的通用的暴露前「3 针法」和暴露后「5 针法」,尽管添加氢氧化铝佐剂可以增加免疫效果,但会导致机体免疫应答缓慢,产生中和抗体延迟。由于狂犬病疫苗主要用于暴露后免疫,疫苗诱导免疫的时效性非常重要。
2005 年,国家食品药品监督管理局要求去除氢氧化铝佐剂。临床研究显示,去佐剂疫苗的早期免疫反应明显高于佐剂疫苗,初次免疫 14 天中和抗体阳转率可达 100%,且不良反应发生率低。1990 年以来,我国研制或引进 Vero 细胞为基质的纯化狂犬病疫苗大量上市,2014 年,国产人二倍体细胞疫苗也批准上市,疫苗种类不断增多,我国目前批准上市的人用狂犬病疫苗种类见表 1。

3. 人用狂犬病疫苗免疫程序的演变
人类最早由路易巴斯德应用感染狂犬病病毒的干燥兔脊髓悬液的减毒活病毒尝试预防狂犬病,连续注射 13 针而获得成功。之后研发的灭活神经组织疫苗需连续接种 14~21 针。随着细胞培养疫苗的出现,疫苗的免疫原性有了较大提高,通过实验不同免疫针次和间隔时间进行抗体应答比较,
对于效价高于 2.5IU/ 剂的细胞培养疫苗可采用简化的接种程序,欧洲率先采用 0、3、7、14、28、90 天注射的 6 针接种程序。随着研究数据的积累发现第 6 针疫苗的接种并不能显著提高抗体水平,所以改为根据受种者机体的具体情况决定是否接种第 6 针,一般情况下仅需要接种 5 针。之后,「5 针法」被 WHO 推荐且目前仍在全球广泛应用。
1984 年,前南斯拉夫的 Zagreb 公共卫生研究院针对不同种类狂犬病疫苗进行不同间隔接种的免疫程序及优化接种程序的探索研究,结果显示,于 0 天左右上臂三角肌各接种 1 剂,7、21 天再分别接种 1 剂的免疫程序所产生的中和抗体时间较早,且水平也较高,此免疫程序被称为「2-1-1」程序。1992 年 WHO 在狂犬病专家委员会第八次会议中正式推荐应用。
美国免疫实施顾问委员会(AdvisoryCommittee on Immunization Practices,ACIP)于 2009 年在综合已发表文献的基础上,建议健康成年人在规范处置的情况下,可采取原 5 针免疫程序减少最后 1 针的方法,即在 0、3、7、14 天注射的「简易 4 针法」免疫程序。
目前,WHO 推荐的暴露后免疫肌内注射程序包括「5 针法」(Essen 法)、「2-1-1」程序(Zagreb 法)以及 ACIP 推荐的「简易 4 针法」。推荐的暴露前免疫肌内注射方案为 3 剂疫苗,分别在 0、7 和 21 或 28 天接种。我国批准上市的狂犬病疫苗的暴露后免疫程序包括「5 针法」和「2-1-1」程序两种,各疫苗的免疫程序以国家食品药品监督管理总局批准的疫苗使用说明书为准。
4. 人用狂犬病疫苗的免疫机制、毒株及质量标准
狂犬病病毒 RNA 编码核蛋白(N)、M1、M2、病毒包膜糖蛋白(G)和 L 五种蛋白,其中 G 蛋白是狂犬病病毒最主要的抗原,可有效刺激特异性辅助性 T 细胞(helper T,Th)和细胞毒性 T 细胞(Cytotoxic lymphocyte,CTL)增生,并诱导机体产生特异性抗体。
G 蛋白特异性抗体是狂犬病疫苗最重要的保护性抗体,免疫效果主要依赖其抗原表位、结构、蛋白折叠及糖基化等。N 蛋白也是一种有效的保护性抗原,能够刺激 B 细胞和 Th 细胞诱导产生细胞和体液免疫。
磷蛋白(P)可诱导 CTL,但保护作用较弱。机体在接种狂犬病疫苗约 7 天左右产生 IgM(Immunoglobulin M)抗体,在约 14 天后产生 IgG(Immunoglobulin G)抗体并迅速升高。
IgM 和 IgG 抗体均具有中和病毒的能力,有些中和抗体能进入感染狂犬病病毒的神经细胞内抑制病毒复制。CTL 的高峰出现在免疫后 12 天,可清除中枢神经系统内的狂犬病病毒,Th 细胞可增强抗核蛋白和糖蛋白抗体,也能增加保护效果。但 Suss 的研究认为细胞免疫在狂犬病中的作用不明。
由于狂犬病病毒核蛋白序列高度保守,氨基酸同源性达 78% 至 93%,故病毒之间在核壳体水平上存在着广泛的抗原交叉反应。狂犬病病毒的主要抗原部位为 G 蛋白外功能区,当其氨基酸同源性 >74% 时,病毒之间能够交叉中和,为同一遗传谱系内的病毒;膜外区的氨基酸同源性 <62% 时,则无交叉中和反应。目前疫苗株均属于遗传谱系 I,对遗传谱系 II 中的病毒感染不具保护作用。
现已经有十余个种类或基因型的狂犬病病毒属病毒被描述为狂犬病的病原体。目前为止,遗传谱系 I 的狂犬病病毒是引起人狂犬病的最常见的病毒型别,也是至今应用于狂犬病疫苗生产的唯一病毒种类。故现有疫苗可能无法为遗传谱系 I 外的其他血清型病毒感染提供保护。
因此,用于疫苗的病毒种类必须慎重选择。生产用毒种应是在实验室细胞培养适应和减毒,并具有稳定生物学特性的固定毒株,其历史和来源应确证清楚,并经过全面的特征性检定,符合国家相关文件的要求。病毒灭活后制成的疫苗对人体安全且能产生有效的免疫保护作用。
WHO 推荐用于疫苗生产的病毒固定毒株包括 Pasteur Virus、Pitman-Moore、Vnukovo-32、Flury 鸡胚细胞低传代株(Low egg passage LEP)和 CTN 株等。
人用狂犬病疫苗应符合 WHO 生物制品标准专家委员会(Expert Committee on Biological Standardization, ECBS)制定的指导原则中对疫苗特性、生产及质量控制的要求。用于制备疫苗的细胞基质应来源于健康动物,动物来源品系清楚。
根据现行《中国药典》的要求,动物必须是清洁级或以上的动物。所用动物应符合实验动物微生物学和寄生虫学检测要求的相关规定。人二倍体及传代细胞应在限定代次内使用。病毒在细胞(或胚蛋)中增殖后,将收获的病毒进行浓缩、纯化、灭活,加入保护剂冻干而成。
细胞培养疫苗的最低效价为在效期内每一剂肌注剂量达 2.5IU 以上,由 NIH 法检测确定。ELISA 法检测糖蛋白等其他体外测定方法目前仍处于实验室验证阶段,但该方法已用于生产过程中抗原含量的控制。
疫苗需经临床前研究及临床试验,企业需获得国家食品药品监督管理总局批准的生产许可证方可生产疫苗。WHO 建议对新申请注册的疫苗,在临床试验中检测 0、14、28/30、180、360 天血清中和抗体水平。已经获准生产的人用狂犬病疫苗需按照国家食品药品监督管理总局的要求申请批签发,仅有获得批签发合格证的狂犬病疫苗批次方可上市使用。
5. 疫苗的血清学效果评价
WHO 仅推荐小鼠脑内中和试验和荧光灶抑制试验(RFFIT)检测中和抗体,两种方法均可以正确评价疫苗免疫后的中和抗体水平,WHO 认为免疫后血清中的病毒中和抗体 ≥ 0.5IU/ml 即达到有效保护水平。
国内外疫苗的临床研究数据显示,疫苗按暴露后的「5 针法」或「2-1-1」等免疫程序接种,大多可在接种后 7 天出现中和抗体,14 天 100% 抗体阳转。而美国 ACIP 认为,疫苗暴露后免疫的 14~28 天中和抗体滴度已处于峰值,28 天的第五针注射不能使抗体继续升高,因此,推荐美国健康成年人的暴露后免疫采用 0、3、7 和 14 天的 4 针免疫程序。
(1)暴露前免疫
Morris 的研究显示,接受 3 针狂犬病疫苗,所有接种者的血清抗体均阳转,但抗体滴度与年龄增长呈负相关。我国使用国产纯化人 Vero 细胞疫苗按照 0、7、21 天各 1 针的程序进行暴露前免疫,结果显示,受试者血清中和抗体阳转率为 100%,几何平均滴度(Geometric mean titer, GMT)为 15.87IU/ml。Sehgal 的研究显示,采用 0、7、21 天程序的暴露前免疫血清中和抗体 GMT 为 7.08 IU/ml 。
使用人二倍体细胞疫苗和 Vero 细胞疫苗分别采用 2 针(0、28 天)和 3 针(0、7、28 天)程序进行暴露前初次免疫,结果显示,初次免疫 2 针组 1 年后抗体明显下降,但 3 针组抗体阳性率仍能维持在 87.9%_100%,加强免疫 1 针后 14 天抗体水平迅速提高。
暴露前程序经加强免疫后抗体可维持较高水平,免疫后 3 年时仍为 12.6IU/ml,5 年时为 10.6IU/ml,第 10 年至少可维持 96% 阳性。此外,在满 10 年时再次加强免疫 1 针,观察全部对象的抗体滴度几乎又恢复到满 1 年加强 1 针后 14 天的水平。
(2)暴露后程序
a.「5 针法」程序的保护性研究 2009 年,Rupprecht CE 对 1976 年至 2008 年间发表的 12 篇狂犬病疫苗研究进行 meta 分析。全部研究共包含 1000 名受试者,所有受试者在第 1 针疫苗免疫后 14 天均产生中和抗体,使用细胞培养疫苗进行免疫接种后产生的抗体滴度一般高于 10IU/ml。
王凌云等发现,对 2~67 岁健康人群按「5 针法」免疫程序分别接种国产和进口冻干 Vero 细胞疫苗,接种后 7 天、14 天两种疫苗血清抗体水平无显著性差异,且首剂接种后 45 天的抗体阳转率均达 100%,14、45 天血清中和抗体 GMT 均大于 0.5IU/ml,两种疫苗间无统计学差异。
叶茂华等发现,经实验室确诊为狂犬病的犬只咬伤的 7 例暴露者使用 5 针法免疫后,全部获得保护。Zhang Xiaowei 一项使用「5 针法」免疫的持续 5 年的疫苗持久性研究显示,接种后产生的中和抗体具有良好持久性及免疫记忆效应。
.「2-1-1" 程序的保护性研究
Zagreb 研究中心的研究结果显示,分别采用人二倍体细胞疫苗、原代牛肾细胞疫苗、纯化鸡胚细胞疫苗、Vero 细胞疫苗按「2-1-1」程序免疫,第 7 天抗体阳转率分别为 65%、38%、83% 和 78%,14 天时全部阳转,抗体水平达到高峰,GMT 为 17.0-54.9IU/ml,继续观察至 28 天抗体水平基本保持不变。
与 0、7、21 天各接种 1 针相比,抗体水平较高。多项血清学研究显示,与 5 针程序相比,「2-1-1」程序第 7 天抗体阳转率和血清抗体水平均更高,14 天和 42 天抗体水平无差异。
对于被狂犬咬伤的实际保护效果,Wasi 在泰国进行的一项原代鸡胚细胞纯化疫苗临床观察中,82 名确认为被狂犬病动物致伤的暴露者分别采用「6 针法」(0、3、7、14、28、90 天各接种一针)和「2-1-1」程序进行免疫接种,根据暴露的严重程度,部分暴露者同时注射狂犬病人免疫球蛋白。
两种方法显示出相似的免疫应答,均能快速提供足够的抗体保护。所有暴露者接种后 1 年 100% 存活,中和抗体 GMT 仍高于 0.5IU/ ml 的保护性水平。使用 Vero 细胞疫苗对 100 名被狂犬严重咬伤的患者进行「2-1-1」程序免疫,同时注射被动免疫制剂,一年后所有人均存活。
国内对于经实验室确认为狂犬病犬只咬伤的暴露者进行 Vero 细胞疫苗「2-1-1」程序接种并联合应用被动免疫制剂,所有受种者抗体全部阳转,6 月后均存活。
目前对「2-1-1」程序的持久性研究数据有限,Vodopija 在 1997 年开展的研究中,分别采用人二倍体细胞、鸡胚细胞和 Vero 细胞纯化狂犬病疫苗进行免疫,第 1100 天测血清抗体 GMT 为 0.61~0.97IU/ml,给予 1 剂加强后 14 天检测血清抗体水平,GMT 增高至 14.28~28.81IU/ml 。
(3)特殊人群
Vodopija R 的研究表明,使用原代鸡胚细胞纯化疫苗的「5 针法」免疫程序接种无临床症状的人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染者,首剂接种后 14 天抗体阳转率为 64%,30 天为 89%。
有明显临床症状的艾滋病(Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS)病人,且 CD4+(cluster of differentiation 4)细胞数低于 300/rriri3 者,对狂犬病疫苗免疫应答很差,首剂接种后 14 天抗体阳转率仅为 25%,30 天仅为 42%。
对于使用免疫抑制药物的患者,狂犬病疫苗接种后应监测患者是否具有适当的病毒中和抗体应答。妊娠妇女几乎均能对狂犬病疫苗产生正常的免疫应答,且对胎儿不会造成不良影响。对接受器官移植的儿童进行肌内接种免疫反应良好。
(4)疫苗效力及免疫失败
icholson 估计在发达国家中应用细胞培养疫苗免疫失败率为每 8 万人中 1 例,而发展中国家为每 1 万 2000 到 3 万人中发生 1 例。
早期最著名的狂犬病疫苗的保护性研究案例之一,是伊朗对 45 例被狂犬病动物致伤的患者接种 6 针次疫苗并联合注射抗狂犬病血清,所有接受暴露预防处置者均存活。
出于伦理的考虑,对狂犬病疫苗有效性的研究不可能设置安慰剂对照,而仅可通过以往经验和案例记载估算,如不经疫苗免疫,预计有 35% 的严重致伤者将患狂犬病死亡。后续在德国、美国以及泰国的狂犬严重暴露后免疫研究均得到类似的结果。
绝大多数狂犬病的发病是由于没有接受规范的暴露后预防处置,包括接受暴露后处置较晚,多处咬伤等严重暴露,以及头、颈部咬伤时难以彻底进行伤口清洗等。Krebs 对于 28 例使用疫苗后仍发病的案例进行回顾性分析发现,90% 的病例未应用被动免疫制剂,或者应用方法不当。
其他操作失误包括应用疫苗 24 小时前进行了被动免疫、局部伤口清洗不当、多部位咬伤未发现细小伤口而遗漏处理、疫苗注射部位不正确(如注射臀部而非三角肌)。只有两例为严重面部咬伤的患者,虽进行了被认为正确的暴露后处置仍然发病。
一项使用原代鸡胚细胞纯化疫苗的有效性随访研究共报道 46 例可疑失败病例,43 例发生在印度,3 例发生在泰国,分析显示所有案例均未完全执行 WHO 的暴露预防处置指南。
2007 年 Wilde 等研究综合报道了 7 例失败病例,均经过正确规范的伤口处理和暴露预防处置,并接受人二倍体细胞疫苗或 Vero 细胞疫苗及抗血清或人免疫球蛋白注射。
免疫失败的原因可能包括:
a.  存在不易察觉的微小穿透性损伤,致使伤口未得到冲洗、消毒,局部未注射免疫球蛋白;
. 病人伴有未被发现的免疫功能减低性疾病或应用免疫抑制性药物而未报告。
王世清的研究显示,暴露后处置失败率为 1.24/ 万,主要原因为狂犬病被动免疫制剂应用率低,未完成全程接种等。
(5)疫苗安全性
WHO 的立场文件中指出,不同种类狂犬病疫苗的安全性和耐受性整体较好。不良反应的出现与狂犬病疫苗的纯度、制备工艺、处方成分及剂型有关,并可能与产品各批次间的差异相关。
此外,疫苗的使用方式(如肌肉注射或皮内注射)和受种者的个体差异也有影响。据统计,约有 35%~45% 的受种者接种部位会出现一过性轻微红疹、疼痛和 / 或红肿,在接种加强针次时尤为显著。5%~15% 的受种者曾观察到一过性发热、头痛、头晕、胃肠道症状等轻微全身不良反应,过敏、神经系统症状等严重不良反应罕见。
1997~2005 年,据美国疫苗不良事件报告系统(Vaccine Adverse Event Reporting System,VAERS)显示,在鸡胚细胞疫苗的所有不良反应中严重不良反应占 7%,主要为神经系统反应和过敏反应,神经系统反应临床表现不一,过敏反应主要表现为荨麻疹、皮疹和血管性水肿。
对人二倍体细胞疫苗安全性和免疫原性的观察中,超过 1770 名志愿者中观察到的不良反应如下:严重上臂疼痛(15%~25%);头痛(5%~8%);不适、恶心,或两者兼有(2%~5%);过敏性水肿(0.1%),过敏反应主要发生于加强免疫之后。加强免疫后,全身过敏反应发生率上升至 6%。
细胞培养疫苗的神经系统并发症少。在注射人二倍体细胞疫苗的数百万个体中,共报告发生 5 例中枢神经系统疾病,包括 GBS 及急性播散性脊髓炎,不超过疾病的基础发生率,可能与接种疫苗无关。目前大规模使用的 Vero 细胞疫苗及原代鸡胚细胞纯化疫苗的神经系统并发症与人二倍体细胞疫苗相仿。
国内对国产与进口 Vero 细胞疫苗安全性对比研究发现,国产疫苗的局部红肿、硬结、疼痛、瘙痒的发生率分别为 1.4%、0.8%、17.1% 和 2.4%;发热、皮疹、头痛、疲劳乏力和其他全身反应的发生率分别为 1.2%、0.4%、2.4%、4.2% 和 0.3%,上述不良反应均在第 7 天完全消失,与进口疫苗的安全性基本一致。
对于肌内接种和皮内接种的不良反应发生率比较,有部分研究显示二者并无显著性差异,但也有研究显示皮内接种的不良反应发生率高于肌内接种,主要表现为局部红斑、疼痛和肿胀,但总体来讲反应较轻微。目前的研究表明,「2-1-1」程序与「5 针法」程序比较,不良反应发生率无显著性差异。
研究表明,孕妇接种狂犬病疫苗是安全的,并且不会对胎儿造成影响。对 202 名孕妇接种 Vero 细胞狂犬病疫苗的观察发现,孕妇的不良反应发生率与非孕妇无显著性差异,国内大量研究的结论与上述观点一致。
(6)暴露前及暴露后预防成本效益评价
国外对于暴露后预防成本效益的相关评价,由于研究地区的自然、社会和经济条件不同,得到的结论也不尽相同。Pannipa 关于泰国儿童暴露前预防与暴露后预防的成本比较发现,当犬咬伤率达到 2%~30% 时,对于儿童采取暴露前免疫和暴露后免疫的预防成本一致,具体取决于应用何种暴露后程序。
美国的研究表明,当感染狂犬病的可能性大于 0.7% 时候,暴露后免疫是经济的。对于低风险区,避免 1 例发病的成本在 50 万到 100 万美金之间,具体数额取决于风险程度。Shim 在坦桑尼亚的研究显示,每伤残调整生命年(Disability Adjusted Life Year,DALY)医疗花费为 27 美元,政府花费为 32 美元。成本效益较低,但对于 1% 的真正暴露于狂犬病的人群来说,非常符合成本效益原则。
国内学者周世红通过建立暴露前及暴露后预防方案的狂犬病发病(死亡)及成本的决策树模型,进行成本效果分析和敏感性分析。在每 10 万人中,暴露前预防可避免 12 人发病,暴露后预防可避免 8 人发病,暴露前预防避免 1 例发病的成本为 273.34 万元,暴露后预防避免 1 例发病的成本为 19.60 万元,前者为后者的 14 倍。
王传林等对暴露后 5 针程序和「2-1-1」程序进行经济成本分析,测算直接医疗成本、直接非医疗成本和间接成本,两种程序的就医成本分别为 694 元、482.2 元,每名患者节省超过 210 元,按每年暴露后接种疫苗 1400 万人计算,采用「2-1-1」程序,全国的就医总成本将节约 29.63 亿元。
被动免疫制剂
WHO 狂犬病专家咨询委员会建议,对于狂犬病病毒 III 级暴露者,应在接种疫苗的同时对伤口进行彻底清洗并在周围浸润注射被动免疫制剂,即人狂犬病免疫球蛋白或马源抗狂犬病血清,以阻止病毒进入神经组织从而获得快速保护作用。另外,对于免疫功能严重低下的暴露者,即使 II 级暴露,也应联合应用被动免疫制剂。
1. 被动免疫制剂的种类
目前国际上狂犬病被动免疫制剂可分为马源免疫球蛋白(Equine rabies immune globulin,ERIG)、马源纯化 F(ab')2 片段制品和人源免疫球蛋白(human rabies immune globulin,HRIG)三种,前两种在国内习惯上沿用「马抗狂犬病血清」的名称(Equine rabies antiserum,ERA)。
我国被批准上市的为马源纯化 F(ab')2 片段制品和 HRIG。依据现行《中国药典 》标准,HRIG 产品效价标准为不低于 100IU/ml,而 ERIG 产品效价标准为不低于 200IU/mL。
HRIG 是采集经人用狂犬病疫苗免疫的人的血浆,采用低温乙醇蛋白分离或其他经批准的分离制造工艺获得的抗狂犬病免疫球蛋白(IgG)。
马源纯化 F(ab')2 片段制品为采用不含人源成分的狂犬病病毒抗原免疫马匹后采集血浆,采用硫酸铵盐析方法获得 ERIG,在 ERIG 基础上经胃蛋白酶水解切除 Fc 段保留完整的 F(ab')2 并高度纯化所得。
ERIG 因其来源相对方便和经济,国内早期暴露后的被动免疫制剂以此产品为主。目前的马源制品均为胃蛋白酶水解制备的 F(ab')2 片段,并改进了纯化方法,以尽量提高制剂的比活性。国内外马抗狂犬病血清的总蛋白含量标准均为 ≤ 17 g/100 ml,国内产品的纯度往往在 10 g/100 ml 左右,其中 F(ab』)2 片段含量不低于 60%,完整 IgG 的含量不高于 10%。
国内 ERA 制品的总蛋白含量绝对值仍须进一步降低,以减少或减轻人体使用后可能引起的异源蛋白所致的不良反应(如血清病,过敏性休克等);其另一个缺点是由于在人体内半衰期较短,因此所需注射剂量比 HRIG 高,增加了不良反应的风险。与此相对,HRIG 由于无异源蛋白反应风险,故不良反应率较低,但其缺点是需要不断从加强免疫的健康人群中获得,来源相对困难,价格昂贵。两者的优缺点比较见表 2 所示。

目前国内生产狂犬病被动免疫制剂的企业及其产品规格详见附表 2。随着狂犬病人免疫球蛋白的供给量增加,患者经济负担将随之减少。
2. 被动免疫制剂的作用机制
抗狂犬病血清作为狂犬病病毒的特异性被动免疫制剂,无需机体免疫应答过程就能够对狂犬病病毒进行即时中和。其主要作用为在疫苗诱导机体产生有效抗体之前,在患者暴露部位立即提供所需的中和抗体,其作用迅速但短暂。而疫苗诱导产生抗体虽需 1~2 周的时间,但抗体可持续存在数年。
从图 3 可以看出狂犬病疫苗暴露后免疫程序启动后分别在 0、3、7、14、28 天诱导产生的抗体滴度变化趋势(实折线),在第一针疫苗注射后至机体产生足量抗体(>0.5IU/mL)之前(主动免疫诱导的保护力空白区或称高风险感染期),被动免疫制剂可为该高风险时段提供免疫保护。
在高风险感染期伤口周围浸润注射的被动免疫制剂可使伤口局部获得高浓度的中和抗体,阻断病毒在伤口中的扩散。值得注意的是,伤口周围浸润注射的中和抗体并不会令外周循环中的抗体水平明显增高,外周循环中的中和抗体水平增高主要依赖于疫苗注射后产生的主动免疫保护。
因此,该阶段被动免疫制剂的浸润注射对疫苗所提供的主动免疫保护所产生的干扰并不严重,但首剂疫苗注射 7 天后,机体已产生较高水平的中和抗体,此时再注射被动免疫制剂已无意义。
3. 被动免疫制剂的保护效果
根据 WHO 狂犬病专家咨询委员会建议,原卫生部颁布的《狂犬病暴露预防处置工作规范(2009 年版)》以及狂犬病疫苗使用说明书等相应规定,III 级暴露即一处或多处皮肤出血性咬伤或被抓伤出血,或被不能确定健康状况的动物唾液污染粘膜,应按暴露后程序在彻底清洗伤口的基础上立即接种疫苗并注射 ERA 或 HRIG。
ERA 按 40IU/kg 给予,HRIG 按 20IU/kg 给予,将被动制剂尽可能多的在咬伤局部浸润注射,剩余部分肌肉注射。对于艾滋病病人等免疫力低下人群,WHO 专家建议即使是 II 级暴露也应联合使用被动免疫制剂。
被动免疫制剂的正确使用十分重要,基本原则是首先在受伤部位局部进行浸润注射,可直接中和刚进入体内的病毒,构建阻遏病毒从伤口向周边神经组织蔓延的第一道屏障。国内很多暴露后免疫失败病例,是因未联合使用被动免疫制剂或使用方法不当造成的。
Khawplod 的研究指出,已单独使用疫苗,而未能及时使用被动免疫制剂的 III 级暴露者,在 7 天内仍应考虑给予被动免疫制剂,其主要依据为在此期间内机体对疫苗的主动免疫保护尚未产生,而局部伤口的浸润注射对于使用疫苗后机体主动免疫产生的影响较小。
抗狂犬病被动免疫制剂的应用最早可追溯到 1891 年,当时即有报道采用疫苗免疫的人全血治疗被疯狼严重咬伤者。此后采用抗血清治疗暴露后病例的案例时有报道,但疗效无法肯定。
WHO 狂犬病专家咨询委员会通过现场观察肯定了疫苗与被动免疫制剂的联合应用效果。1954 年在伊朗一起疯狼咬伤 18 人的事件中,5 人仅单用疫苗治疗,最终 3 人患狂犬病死亡;而暴露程度相似的另外 13 人采用疫苗联合抗血清治疗,最终仅 1 人患病死亡。
伊朗一项为期 17 年的调查显示,单纯用狂犬病疫苗的 298 名重伤病人病死率为 25%,而在疫苗联合抗血清处置的 364 名重伤病人病死率仅为 5.3%。对感染狂犬病病毒的动物模型的研究也发现,尽管均接种狂犬病疫苗,但是否联用抗狂犬病被动免疫制剂的保护效果存在显著性差异。
我国已有多起关于疫苗与被动免疫制剂联合应用效果自然对照的报告。1981 年和 1982 年先后报告两起狂犬病动物伤多人事件,暴露者共 58 人,重伤者中单纯应用疫苗的 3 人均发病死亡,而及时采用疫苗联合马抗狂犬病血清治疗的 26 人均存活。
2004 年,江西省景德镇一狂犬咬伤 29 人,其中 III 级暴露 12 人,1 人未接种疫苗和抗血清发病死亡,而另外 11 人采用疫苗和被动免疫制剂联合处置后全部存活。2010 年报告的一起狂犬咬伤多人面部事件中,单纯采用疫苗治疗的暴露者发病死亡,而其余暴露者采用联合被动免疫制剂治疗后均存活。
由此可见,在疫苗初次免疫接种后的有效中和抗体产生前的窗口期,采用被动免疫制剂联合治疗至关重要,III 级暴露者尤甚。
4. 被动免疫制剂的安全性
最早上市的抗狂犬病被动免疫制剂为马抗狂犬病血清,因血清病发生率高达 40%,美国于 1965 年停止了该抗血清的使用。目前应用的马抗狂犬病血清为利用胃蛋白酶切除 ERIG 免疫球蛋白 Fc 段,通过纯化提高制剂中 F(ab')2 纯度并降低其他血清蛋白成分及过敏物质含量的纯化制剂。
部分马抗狂犬病血清制剂有引起血清病的风险,取决于其总蛋白质含量。一项对使用者的研究发现,ERIG 制剂血清病的发生率从 0.82% 至 6.19% 不等。与 ERIG 相比,纯化的 F(ab')2 制剂血清病发生率大幅降低,且大部分为轻症病例。尽管 F(ab' )2 制剂安全性较好,但由于无法完全除去异性蛋白,仍然不能排除引起个别敏感者出现不良反应的风险。
与马抗狂犬病血清相比,狂犬病人免疫球蛋白(HRIG)则不存在因异源蛋白等因素而导致过敏的风险,不良反应发生率相对更低。其存在的另一个问题就是因其来源于人,理论上具有传播血源性病原体的潜在风险。因此在 HRIG 制品的生产工艺中除采用低温乙醇法外还增加了严格的病毒灭活 / 去除工艺。国内大量的实验和资料证实,目前国内外上市的 HRIG 具有很高的安全性。
5. 经济成本与研究进展
对 HRIG 的经济学研究很少。由于诱导免疫的疫苗成本、人体免疫应答的时间成本以及免疫供血员的人力成本等因素,HRIG 的生产成本非常高。加之 HRIG 要求血清抗体滴度不低于 10IU/mL,对其产量造成限制,故 HRIG 的价格较为昂贵。
马抗狂犬病血清生产成本相对低廉,价格一般为 HRIG 的十分之一,对于发展中国家,ERIG 不失为一种安全、有效的产品。但基于综合因素考虑,美国免疫实施咨询委员会(ACIP)仍优先推荐 HRIG。
鉴于上述被动免疫制剂供应量有限,价格偏高,且存在血清病类过敏反应和血源传播疾病的潜在风险,目前,狂犬病治疗性单克隆抗体研究已取得较大进展。如 2005 年 Bakker 小组获得高亲和活性的人源化单抗 -McABCR57。Lina Sun 等也已成功研发多株具有中和活性的人源化狂犬病治疗性单抗。
依据 WHO 建议,抗狂犬病单克隆抗体制剂应将针对病毒不同抗原位点的多株单抗组合成「鸡尾酒式」组合制剂,以保证单抗制剂对不同病毒株或病毒的不同基因型的有效性。但上述人源化治疗性单克隆抗体离正式商品化尚有一定距离。
狂犬病的预防建议
1. 暴露前预防
(1)基础免疫
所有持续、频繁暴露于狂犬病病毒危险环境下的个体均推荐进行暴露前预防性狂犬病疫苗接种,如接触狂犬病病毒的实验室工作人员、可能涉及狂犬病病人管理的医护人员、狂犬病病人的密切接触者、兽医、动物驯养师以及经常接触动物的农学院学生等。此外,建议到高危地区旅游的游客、居住在狂犬病流行地区的儿童或到狂犬病高发地区旅游的儿童进行暴露前免疫。
免疫程序:第 0 天、第 7 天和第 21 天(或第 28 天)分别接种 1 剂,共接种 3 剂。
接种途径、部位和剂量:肌内注射。2 岁及以上儿童和成人于上臂三角肌注射;2 岁以下儿童于大腿前外侧肌注射。禁止在臀部肌肉注射。每剂 0.5 ml 或 1.0 ml(具体参照产品规格或产品说明书)。
(2)加强免疫
如出于暴露前预防的目的,则已接受全程基础免疫者无需定期进行加强免疫。定期加强免疫仅推荐用于因职业原因存在持续、频繁或较高的狂犬病病毒暴露风险者(如接触狂犬病病毒的实验室工作人员和兽医)。
免疫程序:接触狂犬病病毒的实验室人员每 6 个月监测一次血清中和抗体水平;兽医、动物疫控部门等每 2 年监测一次血清中和抗体水平。当血清中和抗体水平 <0.5 IU/ml 时需加强接种 1 剂。
接种途径、部位和剂量:肌内注射。2 岁及以上儿童和成人于上臂三角肌注射;2 岁以下儿童可在大腿前外侧肌注射。每剂 0.5 ml 或 1.0 ml(具体参照产品规格或产品说明书)。
(3)使用禁忌
对于暴露前预防,对疫苗中任何成分曾有严重过敏史者应视为接种同种疫苗的禁忌症。妊娠、患急性发热性疾病、急性疾病、慢性疾病的活动期、使用类固醇和免疫抑制剂者可酌情推迟暴露前免疫。免疫缺陷者不建议进行暴露前免疫,如处在狂犬病高暴露风险中,亦可进行暴露前免疫,但完成免疫接种程序后需进行中和抗体检测。对一种品牌疫苗过敏者,可更换另一种品牌疫苗继续原有免疫程序。
2. 暴露后预防
(1)暴露的定义与分级
狂犬病暴露是指被狂犬、疑似狂犬或者不能确定是否患有狂犬病的宿主动物咬伤、抓伤、舔舐粘膜或者破损皮肤处,或者开放性伤口、粘膜直接接触可能含有狂犬病病毒的唾液或者组织。此外,罕见情况下,可以通过器官移植或吸入气溶胶而感染狂犬病病毒。
按照暴露性质和严重程度将狂犬病暴露分为三级:
I 级暴露:符合以下情况之一者:
a. 接触或喂养动物;
.  完好的皮肤被舔;
c. 完好的皮肤接触狂犬病动物或人狂犬病病例的分泌物或排泄物。
II 级暴露:符合以下情况之一者:
a. 裸露的皮肤被轻咬;
. 无出血的轻微抓伤或擦伤。
首先用肉眼仔细观察暴露处皮肤有无破损;当肉眼难以判断时,可用酒精擦拭暴露处,如有疼痛感,则表明皮肤存在破损(此法仅适于致伤当时测试使用)。
III 级暴露:符合以下情况之一者:
a. 单处或多处贯穿皮肤的咬伤或抓伤(「贯穿」表示至少已伤及真皮层和血管,临床表现为肉眼可见出血或皮下组织);
. 破损皮肤被舔舐(应注意皮肤皲裂、抓挠等各种原因

世界卫生组织关于疫苗立场文件汇总下载

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卡介苗
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霍乱
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白喉
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乙型流感嗜血杆菌
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甲型肝炎
立场文件(2012年7月)pdf, 403kb参考文献 (2012) - 英文pdf, 486kb

乙型肝炎
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本版本属于最新情况,取代2004年7月发布的以往立场文件。

人乳头瘤病毒(HPV)
立场文件(2014年10月)pdf, 961kbGrading of scientific evidence - Efficacy of HPV vaccination in young femalespdf, 180kbGrading of scientific evidence - Immunogenicity of 2 vs. 3 doses of HPV vaccination in immunocompetent girlspdf, 167kbGrading of scientific evidence - Grade table: Efficacy of 2 vs. 3 doses of HPV vaccination in immunocompetent girls to prevent cervical cancerpdf, 167kbGrading of scientific evidence - Protection against anogenital warts conferred by HPV vaccination in immunocompetent girlspdf, 171kbGrading of scientific evidence - Safety of HPV vaccination in HIV infected girlspdf, 250kbGrading of scientific evidence - Efficacy of HPV vaccination in HIV infected girlspdf, 248kbGrading of scientific evidence - Duration of protection conferred by HPV vaccination in immunocompetent femalespdf, 156kbGrading of scientific evidence - Safety of HPV vaccination in young femalespdf, 161kbGrading of scientific evidence - HPV vaccination of males to reduce incidence of cervical cancer in femalespdf, 190kb
 
世界卫生组织关于人乳头瘤病毒(HPV)疫苗的立场文件:内容提要pdf, 608kb要点总结 世界卫生组织关于人乳头瘤病毒(HPV) 疫苗的立场文件 2014年10月pdf, 442kb

流感
立场文件 (2012年11月)pdf, 575kb科学证据的分级(母亲的结果)- 英语pdf, 120kb分级的科学证据(婴儿结局)- 英语pdf, 126kb科学证据的分级(孩子年龄在6个月至2年 - 英文pdf, 131kb分级的科学证据(2至6岁的儿童 - 英文pdf, 145kb分级科学证据(个人年龄在65岁或以上 - 中英文pdf, 131kb科学证据的分级(哮喘 - 英文pdf, 124kb科学证据的分级(HIV呈阳性的人 - 英语pdf, 127kb科学证据的分级(卫生保健工作者 - 英语pdf, 113kb科学证据的分级(卫生保健工作者 - 对老年患者的影响 - 英语pdf, 124kb科学证据的分级(安全怀孕 - 英语pdf, 157kb科学证据的分级(减毒活流感疫苗在2岁至6岁以下的儿童 - 英语pdf, 123kb
 
对流感世卫组织立场文件 - 英文摘要pdf, 88kb介绍:总结关键点 - 对流感世卫组织立场文件 - 英文pdf, 75kb

乙型脑炎
立场文件(2006年8月)pdf, 184kb参考文献 - 英文pdf, 142kb
本版本属于最新情况,取代1998年10月发布的以往立场文件。

麻疹
世卫组织麻疹立场文件(2009年8月)pdf, 550kb
 
科学证据的分级(有效性和安全性)- 英文pdf, 138kb科学证据的分级(期限)- 英文pdf, 117kb科学证据的分级(艾滋病毒)- 英文pdf, 110kb
 
世卫组织麻疹立场文件概要 - 英文pdf, 68kb麻疹立场文件的主要参考文献 - 英文pdf, 173kb麻疹立场文件的主要参考文献(附有概要)- 英文pdf, 150kb介绍:要点归纳-世卫组织麻疹立场文件 - 英文pdf, 2.23Mb

脑膜炎脑膜炎双球菌 立场文件 (2015年2月)
A群脑膜炎球菌结合疫苗:更新后的指导意见(2015年2月)pdf, 209kb世界卫生组织关于A群脑膜炎球菌结合疫苗立场文件的内容提要:更新后的指导意见(2015年2月)pdf, 134kbA群脑膜炎球菌结合疫苗: 更新后的指导意见 (2015年2月)pdf, 2.33Mb

脑膜炎双球菌 立场文件(2011年11月)
立场文件(2011年11月)pdf, 318kb参考 2011年11月(中英文)pdf, 374kb

腮腺炎
立场文件(2007年2月)pdf, 166kb参考文献 - 英文pdf, 108kb
本版本属于最新情况,取代2001年11月发布的以往立场文件。

百日咳
立场文件 (2010年10月1日)pdf, 482kb关于选用百日咳疫苗的指导意见:2014 年 7 月更新pdf, 308kb
 
科学证据分级(安全)- 英文pdf, 57kb科学证据分级(疗效/效益)- 英文pdf, 141kb科学证据分级(持续时间)- 英文pdf, 106kb
 
关于百日咳疫苗的立场文件 - 摘要 (2010年10月1日)pdf, 152kb关于百日咳疫苗的立场文件 - 简报 (2010年10月1日)pdf, 924kb

肺炎球菌
立场文件 (2012年4月)pdf, 453kb
 
23价肺炎球菌多糖疫苗立场文件(2008年10月)pdf, 369kbGRADE表(科学证据的质量分级) - 英文补充信息汇总 - 英文2007年10月文件附有概要的参考文献核心清单 - 英文pdf, 255kb2007年10月文件参考文献扩展清单 - 英文pdf, 316kb
 
脊髓灰质炎
全球消灭脊髓灰质炎前的脊髓灰质炎疫苗及其免疫接种立场文件(2010年6月)。英文原文和法文原文pdf, 409kb
本文件替代2003年7月发布的题为“使用口服脊灰疫苗的国家采用灭活脊灰疫苗”世卫组织立场文件。
科学证据的分级(口服脊灰疫苗的有效性)- 英文pdf, 98kb科学证据的分级(口服脊灰疫苗出生剂量)- 英文pdf, 99kb科学证据的分级(保护期限)- 英文pdf, 113kb科学证据的分级(灭活脊灰疫苗的有效性)- 英文pdf, 95kb科学证据的分级(灭活脊灰疫苗和口服脊灰疫苗的序贯使用)- 英文pdf, 95kb
 
世卫组织脊髓灰质炎立场文件概要pdf, 181kb脊髓灰质炎立场文件主要参考文献-扩展后 - 英文pdf, 139kb脊髓灰质炎立场文件主要参考文献(附有概要)- 英文pdf, 261kb介绍:要点归纳-世卫组织脊髓灰质炎立场文件pdf, 2.81Mb
 
停用口服脊灰疫苗之后的灭活脊灰疫苗立场文件(2006年4月)pdf, 145kb

狂犬病
立场文件(2010年8月)pdf, 390kb
本文件为更新版并用于取代2007年12月公布的关于狂犬病疫苗的立场文件。
科学证据分级(效力)- 英文pdf, 152kbGrading of scientific evidence (duration of immunity) - 英文pdf, 124kbGrading of scientific evidence (safety) - 英文pdf, 152kb
 
狂犬病疫苗WHO立场文件摘要pdf, 93kb狂犬病疫苗立场文件的重要文献 – 延伸阅读 - 英文pdf, 318kb课件:要点小结 – 狂犬病疫苗WHO立场文件pdf, 972kb

轮状病毒
声明:当翻译文件变为可用时,会被更新
立场文件最新情况(2009年12月)pdf, 174kb
 
立场文件(2007年8月)pdf, 166kb2007年文件参考文献 - 英文pdf, 313kb
本版本属于最新情况,取代2003年1月发布的以往立场文件。

风疹
立场文件(2011年7月)pdf, 654kb参考文献 - 英文pdf, 431kb

破伤风
立场文件(2006年5月)pdf, 175kb参考文献 - 英文pdf, 109kb

蜱传脑炎
立场文件 (2011年6月)pdf, 526kb
 
科学证据的分级 (疗效) - 英文pdf, 156kb科学证据的分级 (安全) - 英文pdf, 105kb科学证据的分级 (交叉保护) - 英文pdf, 92kb科学证据的分级 (保护期限) - 英文pdf, 133kb

伤寒
立场文件(2008年2月)pdf, 254kb参考文献 - 英文pdf, 183kb
 
使用新一代疫苗开展伤寒免疫接种的背景文件--向世卫组织免疫战略咨询专家组所做的介绍。2007年11月 - 英文pdf, 588kb
本版本属于最新情况,取代2000年8月发布的以往立场文件。

水痘
立场文件(1998年8月)pdf, 158kb参考文献 - 英文pdf, 82kb

黄热病
声明:当翻译文件变为可用时,会被更新
立场文件(2003年10月)pdf, 182kb参考文献 - 英文pdf, 89kb
 
上次更新:2015年4月1日 查看全部
卡介苗

霍乱


本版本属于最新情况,取代2001年4月发布的以往立场文件。

白喉


乙型流感嗜血杆菌

这个版本是最新的情况,而不是在2006年出版的前一个立场文件。

甲型肝炎


乙型肝炎


本版本属于最新情况,取代2004年7月发布的以往立场文件。

人乳头瘤病毒(HPV)

 


流感

 


乙型脑炎

本版本属于最新情况,取代1998年10月发布的以往立场文件。

麻疹

 

 


脑膜炎脑膜炎双球菌 立场文件 (2015年2月)


脑膜炎双球菌 立场文件(2011年11月)


腮腺炎

本版本属于最新情况,取代2001年11月发布的以往立场文件。

百日咳

 

 


肺炎球菌

 

 
脊髓灰质炎

本文件替代2003年7月发布的题为“使用口服脊灰疫苗的国家采用灭活脊灰疫苗”世卫组织立场文件。

 

 


狂犬病

本文件为更新版并用于取代2007年12月公布的关于狂犬病疫苗的立场文件。

 


轮状病毒
声明:当翻译文件变为可用时,会被更新

 

本版本属于最新情况,取代2003年1月发布的以往立场文件。

风疹


破伤风


蜱传脑炎

 


伤寒

 

本版本属于最新情况,取代2000年8月发布的以往立场文件。

水痘


黄热病
声明:当翻译文件变为可用时,会被更新

 
上次更新:2015年4月1日

流感疫苗到底是打1针还是2针?

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